肾小球系膜细胞中硫氧还蛋白１过表达对基质金属蛋白酶９表达的影响

来源:用户上传      作者: 房绍红　刘心平　施明翰　靳玉宏　贾慧婕　姜玉梅　周宏博

　　摘　要：为进一步探讨硫氧还蛋白1(thioredoxinl，Trxl)过表达对高糖环境下肾小球系膜细胞基质金属蛋白酶9(Matrix metauoproteinase 9，MMP9)表达的影响，采用RT-PCR和明胶酶谱法检测细胞中MMP-9 mRNA和酶活性的变化，用脂质体介导瞬时转染法转染正义TIxl及反义Trxl，观察高糖环境Trxl过表达对MMP9表达的影响，结果表明，HBZY-l高糖组与正常糖组比较，MMP9 mRNA在12h，24h，48h时表达增加(P＜0.05)，同时酶活性于12h、24h、48h也明显增高(P＜0.01)，转染正义Trxl组细胞，MMP-9 mRNA水平及MMP9酶活性，在高糖组与正常糖组差异无统计学意义(P＞0.05)；但转染反义Trxl组和未转染组细胞的MMP9 mRNA水平及酶活性，高糖组均比正常糖组表达增加，差异有统计学意义(P＜0.01)，提示Trxl过表达可抑制高糖环境诱导的肾小球系膜细胞MMP9高表达。
　　关键词：硫氧还蛋白1：基质金属蛋白酶9；肾小球系膜细胞；瞬时转染
　　中图分类号：R587.2　文献标识码：A　文章编号：1007-7847(2007)04-0361-06
　　
　　糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病微血管并发症之一，其主要病理特点为肾脏系膜区系膜细胞增生，大量细胞外基质堆积。系膜区变宽或结节形成及肾小管肾小球基底膜增厚等，系膜区系膜细胞增生，细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)积聚是DN的特征性病理改变，近年关于ECM降解异常的研究已开始受到关注，基质金属蛋白酶类(Matrix metalloproteinases。MMPs)是参与降解ECM的蛋白酶家族，其表达异常是ECM降解异常的重要原因，MMP9作为一种重要的降解ECM的基质金属蛋白酶已引起人们广泛关注，已有研究报道，细胞内氧化应激水平可影响MMP9的表达水平，硫氧还蛋白1是细胞内一种重要的抗氧化蛋白，具有多种生物学功能，如抗氧化应激、促生长、抑制凋亡等，而关于细胞内抗氧化蛋白对MMP9水平的影响目前尚属空白，本实验拟观察高糖环境下Trxl过表达对MMP9表达的影响，为DN系膜细胞外基质生成的调控研究奠定理论基础，也为其治疗与预防提供新的思路。
　　
　　1　材料与方法
　　
　　1．1　材料
　　1．1．1 实验细胞株与质粒
　　大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)购自武汉大学生物保藏中心，人Trxl的重组质粒(PIRESpur03-sense thioredoxin-1，PIRESpur03-anti thioredoxin-1)由美国范德堡大学David P.Carbone教授馈赠。
　　1．1．2　试剂
　　Trizol、RT-PCR试剂盒、LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司： 抗人Trxl多克隆抗体、兔抗人β-actin多克隆抗体均购自Santa cruz公司：辣根酶标记山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；ECL plus购自Amersham公司：DMEM，RPMI-1640购自Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青生物技术公司；胰酶、明胶(gelatine)购自Sigma公司；其它试剂均为进口或国产分析纯。
　　
　　1．2　方法
　　1．2．1　细胞培养
　　HBZY-1常规培养于10％胎牛血清RPMI-1640培养液中，培养条件为37℃，饱和湿度5％C02，每2～3d用0.25％胰酶消化传代。
　　
　　1．2．2　RT-PCR
　　Trizol一步法从细胞中提取mRNA，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定mRNA质量，紫外分光光度计测定总mRNA的浓度及纯度，取1μg总mRNA经RT-PCR试剂盒逆转录得到相应的cDNA，取上述逆转录cDNA作模板进行PCR扩增(引物序列见表1)，扩增条件为94℃预变性2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环后于72℃延伸10min，扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，紫外凝胶成像系统进行半定量分析。
　　
　　1．2．3　明胶酶谱分析法
　　取含10μg蛋白的细胞上清与不含点，巯基乙醇的蛋白上样缓冲液(0.125mol/L Tris-HCl pH6.8，10％甘油，2％SDS，0.01％溴酚蓝)混匀，在含0.1％明胶的10％SDS-PAGE中分离，以洗胶缓冲；液(2.5％ Triton X-100，5mmol/L CaCl2，1μmol/LZnCl2，50mmol/L Tris-HCl pH 7.4)洗胶1h，后置于反应缓冲液(1％Triton X-100，5mmol/LCaCl2，1μmol/L ZnCl2，50mmol/L，Fris，HCIpH 7.4)中37℃孵育过夜，经0.35％考马斯亮蓝染胶后用脱色缓冲液(甲醇25％，冰醋酸10％)脱色以显色条带，用扫描仪扫描湿胶，以密度分析软件(PDI Inc，Quantity One，Version 2.5)测定各条带的密度并以此行酶活性分析，实验重复3次。
　　1．2．4　Western印迹
　　取细胞总蛋白70μg，经15％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳完毕后凝胶上的蛋白以电转移至硝酸纤维素膜，5％脱脂奶粉封闭，一抗37℃孵育1h 30min、二抗37℃孵育1h，ECL plus检测，同时以β-actin作内参照，Trxl一抗1:1000，二抗1:5000；β-actin一抗1:500，二抗1:5000，实验结果使用BIORAD GS-800系统扫描，并定量分析X光片条带的光密度，实验重复3次。
　　1．2．5　转染
　　转染前24h细胞传代。以4×105/mL细胞密度接种于六孔板中，细胞密度达70％～90％时进行转染，用250μL无血清培养基稀释4μg质粒混匀，同时用250μL无血清培养基稀释10μL转染试剂，室温放置5min，将上述两种复合物混合，室温放置20min，将复合物加入到细胞中，轻轻晃动，混匀，6h后换液，48h收细胞。
　　1．2．6　统计学分析
　　采用SPSS10.0统计软件进行数据处理，双侧检验以P＜0.05判定差异有统计学意义，组间资料采用配对t检验，所有数据以均数±标准差x±s)表示。
　　
　　2　结果
　　
　　2．1　RT-PCR检测正常糖和高糖环境下MMP-9mRNA表达水平
　　各时间点正常糖组和高糖组MMP9 mRNA表达结果显示，12h高糖组(HG)是正常糖组(NG)的146±11.3％，差异有统计学意义(*P＜0.05)；

24h HG组是NG组160.9±8.9％，差异有统计学意义(*P＜0.05)；48h HG组是NG组189±13，6％，差异有统计学意义(*P＜0.05)(见图1)，实验结果表明，高糖环境可以引起MMP9 mRNA表达增高。
　　
　　2．2 明胶酶谱法观察正常糖和高糖环境下HBZY-1培养液上清中MMP-9活性的变化
　　各时间点正常糖组和高糖组细胞上清中明胶酶MMP9活性显示，12h HG组是NG组的164.75±18.7％，差异有统计学意义(P**＜0.01)，24h HG组是NG组的163.58±12.4％，差异有统计学意义(p**＜0.01)，48 h HG组是NG组的136.96±9.7％，差异有统计学意义(**＜0.01)，结果表明，48h内高糖环境可诱导明胶酶MMP9活性增强(见图2)。
　　
　　2．3　HBZY-1细胞中正义和反义Trxl质粒转染
　　2．3．1　RT-PCR检测转染正义和反义Trxl质粒
　　RT-PCR结果显示：以β－actin为内参照，转染正义Trxl和反义Trxl组，在421 bp处均有明显的条带，此条带与人Trxl吻合，正常对照组此处无条带(图3)，实验结果表明。HBZY-1成功转染正义和反义Trxl质粒。
　　
　　2．3．2　Western blotting检测转染正义和反叉7rxl质粒
　　Western blotting结果显示：以β-actin为内参照，正义Trxl组与反义Trxl组和正常对照组比较，Trxl蛋白表达明显增高(见图4)，实验结果表明，正义Trxl质粒在HBZY-1中已表达Trxl蛋白。
　　
　　2．4　Trxl过表达对HBZY-1中MMP9表达水平的影响
　　2．4．1　Trxl过表达对HBZY-1中MMP9 mRNA水平的影响
　　以β－actin为内对照，在转染正义Trxl质粒的细胞中(1组，2组)，HG组MMP9 mRNA表达水平和NG组差异无统计学意义(P＞0.05)；在转染反义Trxl质粒的细胞中(3组，4组)，HG组MMP9mRNA表达水平是NG组的163±12.7％，差异有统计学意义(P**＜0.05)；在未转染的细胞中(5组，6组)，HG组MMP9 mRNA表达水平是NG组的134±13.7％，差异有统计学意义(P**＜0.05)，且在正常糖环境下，1、3和5组MMIO mRNA表达水平差异无统计学意义(P**＞0.05)(见图5)，实验结果表明，正义Trxl蛋白可以抑制高糖环境诱导的MMP9 mRNA水平的增高。
　　
　　2．4．2　明胶酶谱法检测Trxl过表达对正常糖和高糖环境下MMP-9活性的影响
　　转染正义Trxl质粒细胞上清中，HG组MMP9酶活性是NG组的103±13.5％，二者差异无统计学意义(P＞0.05)；转染反义Trxl质粒细胞上清中，HG组MMP9酶活性是NG组的137.13±11.6％，差异有统计学意义(P**＜0.01)：未转染组细胞上清中，HG组MMP9酶活性是NG组的122±14.2％，二者差异有统计学意义(P**＜0.01)(图6)，在正常糖环境下，1、3和5组MMP-9酶活性，差异无统计学意义(Pb＞0.05)。实验结果表明，正义Trxl抑制高糖诱导的MMP9酶活性增高。
　　
　　3　讨论
　　
　　DN关键病理过程为系膜细胞增生，细胞外基质积聚和基底膜增厚，系膜基质的成分与含量取决于基质合成与降解之间的平衡，早先的研究主要集中在系膜基质合成方面，而降解能力下降在DN发病中的重要作用近期才开始受到关注，MMPs是一组能降解ECM的锌依赖Ⅱ型蛋白酶，对ECM有广泛的降解作用。是调节ECM动态平衡的最重要的一大酶系，MMP9是参与血管基底膜主要结构成分Ⅳ型胶原降解的蛋白酶，与糖尿病肾病关系密切，已有文献报道，持续高糖环境，系膜细胞MMP9活性升高而后下降，而MMP9活性的变化直接影响Ⅳ型胶原的表达，ECM积聚，系膜基质环境紊乱，所以，推测高糖环境下MMP9早期变化可能是系膜基质成分失衡的观测靶点。
　　本实验结果表明，HBZY-1在高糖环境48h内MMP9的活性明显增加，MMP2活性无变化，此结果说明，高糖环境可以影响系膜细胞内MMP9的活性。Hirakawa报道，MMP-9启动子序列中CA重复序列与DN的关系密切：最近Shiro Uemura报道，高糖环境下细胞外抗氧化剂(N-乙酰半胱氨酸)可以使MMP9启动子活性减弱，并且这种减弱是通过抗氧化剂降低细胞内活性氧生成增多、减轻细胞氧化应激实现的，
　　Trxl是细胞内广泛分布的一种抗氧化蛋白，具有一个高度保守的活性中心位点序列CGPC(-Cys32-Gly-Pro-Cys35)，通过活性中心催化细胞内氧化还原反应，Trx直接的抗氧化作用主要清除体内的自由基，最新的研究表明Trx系统在机体抗氧化方面起着不可忽视的作用。Trx在糖尿病方面的研究报道，高糖环境下，细胞内活性氧、Trx和Trx相互作用蛋白(Vitamin D3 up-rc8ulatedprotein-l，VDUP or TXNIP)体系与p38信号传导途径密切相关，Kobayashi还报道，高糖环境下基因微点阵分析，系膜细胞内Trx相互作用蛋白表达增高，且这种表达趋势的变化与细胞外基质增多密切相关，但高糖环境下，系膜细胞中Trxl表达水平的改变，以及这种变化是否能影响降解细胞外基质的主要酶-MMP9的表达，目前尚无相关报道。
　　本实验选择正义和反义Trxl质粒，其多克隆位点序列经上海生工测序，测序结果表明：正义Trxl与人的Trxl序列100％吻合，且Westernblotting实验也验证了转染的系膜细胞内Trxl蛋白高表达，本实验结果发现，转染正义Trxl组，细胞内MMP9 mRNA的表达水平和酶活性，高糖环境下与正常糖环境比较，无明显差异；而转染反义Trxl组和未转染组中，高糖环境下MMP9 mRNA表达水平和酶活性均较正常糖环境增高，本实验表明，Trxl蛋白高表达可抑制HBZY-1中高糖诱导的MMP-9表达水平的增高，提示Trxl在高糖环境早期系膜细胞基质环境的稳定中发挥重要的作用。但是，我们知道DN是一种慢性疾病，故本实验后续将观察高糖环境下在Trxl稳定转染系膜细胞中Trxl活性增高对MMP9和胶原IV的变化影响，我们的研究将为Trxl是否直接影响细胞外基质的生成研究奠定理论基础，同时也为糖尿病肾病的治疗提供新的思路。
　　
　　作者简介：房绍红(1972―)，女[朝鲜族]，黑龙江哈尔滨市人，硕士研究生，从事与氧化应激相关的生物大分子功能研究；周宏博(1967―)，女，黑龙江哈尔滨市人，教授，硕士研究生导师，通讯作者，从事与氧化应激相关的生物大分子功能研究。

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