动物抗病毒药残留检测方法研究进展

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　　摘要：针对最常用的两种动物抗病毒药物金刚烷胺和利巴韦林，阐述了其抗病毒作用机理及在动物体内的残留，归纳总结了药物残留仪器分析法和生物分析法检测技术的进展，结合抗病毒药物残留检测重要性和实践应用前景提出应发展ELISA检测方法。
　　关键词：抗病毒药；残留检测；动物组织
　　中图分类号：S859.84 文献标識码：A 文章编号：1007-273X（2019）03-0014-03
　　随着畜禽集约化饲养程度提高，动物感染病毒致死的比率高达36.8%[1]，人用抗病毒药物由于价格低、疗效好曾被报道广泛应用于畜禽生产中[2-4]，尤其金刚烷胺类和利巴韦林应用最多、效果最显著。病毒能够通过基因的交换与重组对药物产生抗性，病毒耐药性的产生对人形成潜在威胁，并严重影响药物对人的治疗作用[5，6]。因此，我国农业部第560号公告明令禁止动物使用金刚烷胺、金刚乙胺、吗啉（双）胍（病毒灵）、利巴韦林等抗病毒药物，2005年还发布《关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知》，要求禁止生产、经营和使用金刚烷胺等抗病毒药物防治高致病性禽流感等一类病原微生物引起的病毒性疫病。美国食品药物管理局2006年即禁止在鸡、鸭等动物中使用金刚烷胺等抗流感病毒的药物。但生产中违规滥用仍存在，必须加强药物残留检测。动物源性食品中抗病毒药物残留的检测方法主要有仪器分析法和生物分析法。本文通过对金刚烷胺和利巴韦林两种抗病毒药物抗病毒作用机理的诠释以及在动物体内残留特性，介绍了药物残留检测技术的进展，旨在改进和研发灵敏性、便利性的检测方法来监测动物源食品中抗病毒药物的残留，切实保障人类食品安全水平不断提高。
　　1 抗病毒药物的分类和机理
　　抗病毒药物不破坏病毒体，也不损伤宿主细胞，主要作用在于抑制病毒的增殖，辅助宿主免疫系统抵御病毒侵袭，修复被破坏的组织，缓和病情使之不出现临床症状。常见的抗病毒药物主要分为四类[2]。金刚烷胺类药物抑制病毒复制初期，主要通过阻断病毒基因的脱壳，使病毒核酸不能进入宿主细胞，抑制病毒复制，保护宿主抵御病毒侵袭。神经氨酸酶抑制剂类药物主要通过抑制神经氨酸酶的活性，阻止子代病毒颗粒在宿主细胞的复制和释放，减少病毒的持续时间，如奥司他韦。核苷类药物在病毒复制过程中，药物竞争性地与病毒DNA聚合酶或RNA聚合酶相结合，从而抑制酶活性，干扰病毒核酸的合成，产生抗病毒作用，如利巴韦林。广谱抗病毒类药物对多种病毒增殖期的各个环节都有作用，如吗啉胍等。畜禽养殖中使用最广泛、效果最显著、最具代表性的抗病毒药物为金刚烷胺和利巴韦林。
　　2 抗病毒药物在动物体内的残留
　　抗病毒药物在动物体内多以原型存在，但含量高低不同。不同的抗病毒药物在动物体内的代谢途径及代谢产物存在差异[7]。金刚烷胺在动物体内发生降解代谢的量极少，90%以原型经肾小球滤过随尿排出，部分可被再吸收。利巴韦林在动物体内以原型的代谢形式占多数[8]。在兽药残留检测中主要针对的是可食性组织如肌肉、肝脏等。实际检测过程中检出原型即能满足监管要求，可不采用酶解，以简化步骤，提高监测效率。
　　3 抗病毒药物残留检测的仪器分析法
　　3.1 气相色谱法（GC）
　　气相色谱法是以气体为流动相的色谱过程，具有分离效率高、分析速度快、选择性较好、样品用量少、检测灵敏度较高、操作简单、费用低等优点。20世纪60年代气相色谱法广泛应用于兽药残留分析，大大提高了兽药残留量的检测精度。目前，该法已成为最典型、应用最广的分析方法。Yao等[9]检测金刚烷胺检出限达2 ng/mL。
　　3.2 高效液相色谱法（HPLC）
　　高效液相色谱法（HPLC）是现代分离测定的重要手段，几乎所有的化合物和大分子物质均可用HPLC进行测定。该方法不受样品挥发度和热稳定性的限制，其分离机制与常规色谱柱相同，但填料更加精细（0.5～10.0 μm），在残留检测方面得到了广泛的应用，但存在溶剂消耗量大、色谱柱价格较贵、污染环境等不足。
　　3.3 液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）
　　80%以上的抗病毒药物残留检测方法均是液相色谱串联质谱法，其具有分离效果好、灵敏度高、检出限低、回收率高、重现性好等优点。Berendsen等[10]检测金刚烷胺、利巴韦林等，其定量限为1～10 μg/kg。
　　3.4 高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）
　　高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）在LC-MS/MS基础上发展而来。云环等[11]采用HPLC-MS/MS检测肌肉组织中的金刚烷胺和利巴韦林，检测限为4.0 μg/kg，并在1.0～50.0 ng/mL的范围内线性关系良好，回收率75.9%～108.5%。王维霞[12]采用HPLC-MS/MS检测鸡肉组织中利巴韦林残留量，检出限为2.0 ng/g且在1.0～50.0 ng/mL的范围内线性关系良好，操作简便快捷且准确度高。Higashi等[13]采用HPLC-MS/MS检测大鼠血浆中金刚烷胺等抗病毒药物，检测限为0.025 ng/mL，回收率高于95%。
　　3.5 液相色谱-电喷雾串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）
　　Liu等[14]建立了LC-ESI-MS/MS检测鸡肉组织中金刚烷胺等残留量，最低检出限为0.06～0.30 μg/kg，鸡肝中为0.2～1.0 μg/kg，鸡肉中平均回收率为72.3%～94.2%，鸡肝中为70.8%～92.7%，灵敏度高，准确性好。
　　国内仪器方法上建立了金刚烷胺等抗病毒药物的检测标准并用于定性、定量的检测实施。仪器方法具有高精密度和准确度，且能同时进行多残分析，但仪器昂贵，样品前处理繁琐，需要专业人员操作，更适用于科研机构和国家权威部门对药物的确认检测。
　　抗病毒药物仪器检测法研究进展见表1。从表1中可以看出，方法的检出限在0.06～25.00 μg/kg，能较好地满足抗病毒药物残留检测分析方法的要求。 　　4 抗病毒药物残留检测的生物分析法
　　生物分析法包括免疫法、受体法等。孙海新[5]通过分子生物学方法建立了金刚烷胺受体蛋白表达系统，以评价受体蛋白的亲和活性提出其作为金刚烷胺生物识别材料的潜力。通过优化亲和检测体系参数，最后达到IC50为459 ng/mL，与金刚乙胺的交叉反应率为72%。检测回收率在74%～104%，批内变异系数为5.0%～19.0%，批间变异系数为6.5%～15.5%。这种通过亲和力受体识别药物的想法创新但各方面技术尚不成熟，对药物识别的灵敏度不高。
　　免疫分析法根据待测药物的共性结构或共有结构特征，设计并合成突出其结构特征的半抗原，半抗原与大分子蛋白质偶联后作为全抗原并免疫动物，通过细胞融合获得杂交瘤细胞，收集并纯化杂交瘤细胞分泌的类特异性抗体，利用抗体建立免疫分析法。酶联免疫分析法（ELISA）具有成本低、易操作、高效率、高灵敏度、高特异性等优点，适用于大批量样品的筛选。目前ELISA方法广泛应用于氨基糖苷类抗生素[25]等兽药残留检测，但对金刚烷胺类和利巴韦林残留检测未见文献报道，研究并制备抗病毒药物的有效ELISA检测方法十分有必要。
　　5 结语
　　纵观金刚烷胺和利巴韦林残留检测的实践与发展，尽管仪器监测是最主要的方法，但不适用于高通量筛选，发展起来的ELISA方法因其简单、方便、灵敏度高、特异性好，顺理成章成为当前世界推行的高通量筛选方法。在养殖实践中，受仪器与专业人员的局限，如研制出抗病毒药物ELISA检测试剂盒，能够快速、准确进行残留检测，将发挥重要的作用，并具有广阔应用前景。
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