忍冬果实抗氧化活性研究

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　　摘要：为研究忍冬果实的抗氧化活性，本试验对其乙醇冷浸提取物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，并通过DPPH法、铁氰化钾法和FRAP法评价不同极性部位的抗氧化活性。结果表明：抗坏血酸及忍冬果实各极性部位对DPPH自由基的清除能力为：乙酸乙酯部位>VC>正丁醇部位>石油醚部位;其还原能力为：VC>乙酸乙酯部位>正丁醇部位>石油醚部位;总抗氧化能力为：VC>乙酸乙酯部位>正丁醇部位>石油醚部位。综合分析得出忍冬果实提取物的不同极性部位均有一定的抗氧化活性，其中乙酸乙酯部位的抗氧化活性最显著，石油醚部位的抗氧化活性最弱。
　　关键词：忍冬果实;不同极性部位;抗氧化活性
　　中图分类号：S567.101文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）04-0061-04
　　Abstract In the study， the ethanol cold-dip extract of the fruits of Lonicera japonica was extracted with petroleum ether， ethyl acetate and n-butanol in sequence to obtain three different extracts. And the antioxidant activities of  all the extracts were evaluated by DPPH method， potassium ferricyanide method and FRAP method. The results showed that the abilities of VC and all the extracts to scavenge DPPH radicals were sequenced in the order of ethyl acetate fraction>VC>n-butanol fraction>petroleum ether fraction. Their  reducing power were showed as VC>ethyl acetate fraction>n-butanol fraction>petroleum ether fraction. And the total antioxidant capacity followed the sequence of VC>ethyl acetate fraction>n-butanol fraction>petroleum ether fraction. The different polar fraction of fruits extracts of Lonicera japonicae had certain antioxidant activities， among them， the antioxidant activity of ethyl acetate fraction was the most significant， and that of petroleum ether fraction was the weakest.
　　Keywords Fruits of L. japonica; Different polar fraction; Antioxidant activity
　　忍冬科忍冬屬植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）为半常绿藤本植物[1]，其干燥花蕾或待初开的花、茎枝分别为中药金银花和忍冬藤，具有清热解毒、疏散风热的功效[2]。忍冬果实又称“银花子”或“金银花子”，据《饮片新参》记载，其“味苦凉涩”，具有“清血化湿热、治肠风赤痢”的作用[3]。目前，国内外关于忍冬果实的研究相对较少，仅对忍冬果实极性部位化学成分进行过分析，仅在提取工艺、抑菌活性及挥发油体外抗氧化活性方面有初步研究，未见对忍冬果实醇提物不同极性部位的体外抗氧化研究[4-8]。
　　忍冬果实作为忍冬的副产物，由于对其药用价值认识的欠缺，而未能得到有效利用，尤其是在金银花产量过剩导致大量结果时，更是造成资源浪费。本研究利用溶剂萃取法将忍冬果实提取物分为三个极性部位，通过DPPH法、铁氰化钾法和FRAP法，检测不同极性部位的清除自由基能力、对Fe3+还原能力及总抗氧化能力，评价忍冬果实不同极性部位体外抗氧化能力并确定有效部位，以期加深对忍冬果实药用价值的认识，为其进一步地开发应用提供科学根据。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　 忍冬果实于2017年7月采于山东省莱芜市钢城区（现济南市钢城区）某金银花种植基地。经山东中医药大学药学院郭庆梅教授鉴定为忍冬科植物忍冬L. japonica Thunb.的新鲜果实。
　　1.2 主要试剂与仪器
　　 2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、2-2联苯基-1-苦基肼基（DPPH），上海麦克林生化有限公司产品;抗坏血酸（VC，分析纯），国药集团化学试剂有限公司产品;无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇，均为分析纯。
　　 仪表恒温水浴锅，上海树立仪器仪表有限公司生产;Re-2000型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂生产;TU1901紫外分光光度计，北京普析通用仪器设备有限责任公司生产;SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵，郑州博科仪器设备有限公司生产。
　　1.3 试验方法
　　1.3.1 忍冬果实活性成分提取 取新鲜摘取的忍冬果实2.5 kg，用95%乙醇冷浸提取2次，每次30天，抽滤，合并滤液，旋蒸浓缩得到无醇味浸膏，约1.41 kg。取部分浸膏用适量蒸馏水混悬后，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇溶液萃取至上层萃取液几乎无色。合并相同萃取液，经旋蒸浓缩、水浴蒸干挥干溶剂，分别得到忍冬果实三个极性部位的萃取物，其中石油醚及正丁醇部位呈稠膏状，乙酸乙酯部位呈粉末状，密封后置于冰箱冷藏备用。 　　1.3.2 DPPH自由基清除率的测定 参照文献[9，10]的方法稍作调整。 配制浓度为0.1 mmol· L-1的DPPH无水乙醇溶液。以无水乙醇为溶剂，将不同极性部位的萃取物配制一系列不同浓度的待测样品溶液，25℃暗处放置30 min，以517 nm为测定波长，以无水乙醇为参比溶液，测定吸光度值A，重复检测3次，计算求得平均值作为结果。以抗坏血酸（VC）为阳性对照。按照下列公式计算自由基清除率（K）：
　　K =1-（Ai-Aj）/Ac]× 100%。
　　式中：Ai 为 2 mL DPPH 溶液加2 mL 待测溶液的吸光值;Aj 为 2 mL 待测溶液加2 mL 乙醇的吸光值;AC为 2 mL DPPH 溶液加2 mL 乙醇的吸光值。
　　1.3.3 还原Fe3+能力的测定 参照文献[9，10]的方法稍作调整。将不同极性部位的萃取物配制一系列不同浓度的待测样品溶液。取2.5 mL的不同待测样品溶液，加入2.5 mL的磷酸盐缓冲液（0.2 mol·L-1， pH= 6.6）及2.5 mL的1% K3Fe（CN）6溶液，于50℃水浴中反应20 min，急速冷却，加入2.5 mL的10%三氯乙酸溶液。取反应液5 mL，加入5 mL的蒸馏水和1 mL的0.1% FeCl3溶液，混匀，静置10 min后，以空白对照为参比溶液，于700 nm处测定吸光度值，重复检测3次，计算求得平均值作为结果。以抗坏血酸作阳性对照。吸光度值越大表示还原能力越强。
　　1.3.4 总抗氧化能力的测定（FRAP法） 参照文献[11]的测定方法并稍作调整。FRAP工作液配制：将0.2 mol·L-1醋酸盐缓冲液（pH=3.6）、10 mmol·L-1 TPTZ（溶于40 mmol·L-1盐酸）、20 mmol·L-1FeCl3三者按10∶1∶1的比例混合。TFRAP工作液需临用前配制。
　　 将不同极性部位的萃取物配制一系列不同浓度的待测样品溶液。取600 μL待测样品溶液和6 mL配置好的已预热至37℃的FRAP工作液，混匀，10 min后测定吸光度A，以空白试剂作为参比溶液，以抗坏血酸做阳性对照。根据以上相同步骤，用不同浓度的FeSO4标准溶液（0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.10 mg·mL-1）測定吸光度，以FeSO4的浓度为横坐标（V），以对应的吸光度为纵坐标（W），绘制FeSO4标准曲线。把测得的样品的吸光度A代入FeSO4标准曲线求得相应的FeSO4浓度（mg·mL-1），并以样品浓度为横坐标（x），以相应的FeSO4浓度为纵坐标（y），绘制回归曲线。规定样品的FRAP值与提取的每克干样品中的FeSO4毫摩尔数（mmol·g-1干样品） 等价。
　　2 结果与分析
　　2.1 DPPH自由基清除率分析
　　 由表1可以看出，在忍冬果实不同极性部位样品中，乙酸乙酯部位具有较显著清除DPPH自由基的能力，石油醚和正丁醇部分的清除能力较弱。并且在一定范围内，三种不同极性部位溶液的清除率和浓度间有较好的线性关系，即样品的清除能力与其自身浓度呈正相关，当样品浓度增长到一定值时，各部位的清除率上升缓慢或稳定在一定值。当清除率为50%时，乙酸乙酯部位的IC50值明显小于VC，即其清除效果优于相同体积的抗坏血酸。抗坏血酸及忍冬果实各极性部位对DPPH自由基的清除能力为：乙酸乙酯部位>VC>正丁醇部位>石油醚部位。
　　2.2 还原Fe3+能力的测定（还原力的测定）
　　 由图1可知，忍冬果实提取物各极性部位均表现出一定的对Fe3+的还原能力，但略有差异。各极性部位样品的吸光度A随溶液中样品浓度的增长而增长，表明在一定试验范围内，样品的铁还原能力与样品浓度存在良好的线性关系，对Fe3+的还原力具有显著的量效关系。乙酸乙酯部位的铁还原能力最显著，正丁醇部位次之，石油醚部位作用较弱。抗坏血酸和忍冬果实各提取部位的还原能力为：VC>乙酸乙酯部位>正丁醇部位>石油醚部位。
　　
　　2.3 总抗氧化能力的测定
　　 本试验得出FeSO4标准曲线回归方程为W =7.7597 V+0.0742，RSD=0.9990。由表2可以看出，不同极性部位的总抗氧化能力在一定范围内随各样品溶液浓度的增加而增强。乙酸乙酯部位萃取物的FRAP值较大，即对Fe3+还原能力强，石油醚部位和正丁醇部位的FRAP值较低。乙酸乙酯部位的FRAP值与抗坏血酸的较为接近，表明其所含抗氧化物质活性较强或含有较多抗氧化活性物质。经计算可得，每克石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物和 VC的抗氧化能力相当于80.3、1 383.9、268.4、1 864.4 mg的硫酸亚铁。FRAP值为0.5283、9.1046、1.7658、12.2658 mmol·g-1，因此抗坏血酸及忍冬果实不同极性部位总抗氧化能力为：VC>乙酸乙酯部位>正丁醇部位>石油醚部位。
　　3 讨论与结论
　　 本试验利用溶剂萃取法对忍冬果实醇提物的不同极性部位进行初步分离，并对不同部位的抗氧化性能进行研究。
　　 由于不同抗氧化检测方法的测定机理不同，为获取可靠结论，本试验分别利用DPPH自由基清除法、铁氰化钾法、FRAP法对分离得到的忍冬果实醇提物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位的抗氧化能力进行评价。综合检测结果得到忍冬果实的不同极性部位萃取物体外抗氧化活性为：乙酸乙酯部位>正丁醇部位>石油醚部位。
　　 抗坏血酸作为经典的抗氧化物质，具有很强的抗氧化能力。本试验以抗坏血酸作为阳性对照，发现乙酸乙酯部位的DPPH自由基清除率、铁还原力、总抗氧化能力与抗坏血酸接近，且对DPPH自由基的清除作用强于抗坏血酸，而正丁醇部位和石油醚部位和抗坏血酸数据差别较大，说明乙酸乙酯部位提取物含有相对含量较高或活性较强的具有抗氧化能力的物质。试验结果显示忍冬果实醇提物的乙酸乙酯部位是其体外抗氧化的主要部位。目前，对忍冬果实乙酸乙酯部位提取物采用硅胶柱色谱法、Sephadex LH-20等方法共分离鉴定出7种化合物，分别为熊果酸、齐墩果酸、原儿茶酸、苜蓿素、槲皮素、咖啡酸和木犀草苷[5]。有研究表明，黄酮类物质槲皮素、木犀草苷及酚酸类物质原儿茶酸、咖啡酸具有较高抗氧化活性，且具有邻苯二酚结构的咖啡酸相对于其他酚酸类物质具有较强的抗氧化活性[12]。分析显示，黄酮类物质槲皮素、木犀草苷及酚酸类物质原儿茶酚酸、咖啡酸可能为忍冬果实具有抗氧化活性的主要物质基础。本试验结果可以为忍冬果实的进一步开发应用提供科学依据。 　　参 考 文 献：
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