折溪‘小黄姜’内生细菌初步鉴定

来源:用户上传      作者:刘青 李悦欣 赵德刚 赵懿琛

　　摘    要： 为了解贵州省折溪‘小黄姜’中内生菌资源，采用涂布法从折溪‘小黄姜’中分离、纯化出内生细菌，通过形态学特征结合分子生物学手段确定其分类地位。结果表明，从折溪‘小黄姜’中共分离出5株不同的内生菌，命名为GrsB1、GrsB2、GrsB3、GrsB4、GrsB5，其中GrsB1属于芽孢杆菌科、微小杆菌属（Exiguobacterium），其他4株菌属于肠杆菌科，分别属于拉乌尔菌属（Raoultella）、肠杆菌属（Enterobacter）、埃希氏菌属（Escherichia）、沙雷氏菌属（Serratia），肠杆菌科数量最多。虽然分离出的内生菌数量较少，但菌株种属分布范围较大，可以为小黄姜内生菌资源的进一步研究提供理论基础。
　　关键词： 小黄姜; 内生细菌; 分离; 鉴定
　　Abstract： In this study， In order to understand the endophyte resources of ‘Small yellow ginger’ （Zingiber officinale Roscoe） in Zhexi， Guizhou province， a coating method was used to isolate and purify endogenous bacteria from ‘Small yellow ginger’ ， and its classification status was determined by morphological characteristics combined with molecular biological methods. The results showed that five endophytes were isolated from ‘Small yellow ginger’， named Grsb1， Grsb2， Grsb3， Grsb4 and Grsb5， Grsb1 belongs to Bacillus ， Exiguobacterium. The other four strains belong to raoultella， enterobacter， Escherichia and Serratia in Enterobacteriaceae respectively， the largest number of Enterobacteriaceae. The number of endophytes isolated in this study is small， but the distribution of strains is large， which can provide theoretical basis for further research on the endophyte resources of ‘Small yellow ginger’.
　　植物內生菌是指其生活史的一定阶段或全部阶段生活在健康植物各种组织器官内部或组织间隙中的微生物[1]。Bacon等[2]研究发现，食用有内生菌的高羊茅会使牛、羊中毒，此后，对植物内生菌的研究才引起人们的高度重视。目前在已报道的各种农作物以及经济作物中发现的植物内生细菌已经超过129种，分别属于54个属，主要为假单胞菌属 （Pseudomonas）、肠杆菌属（Enterobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、土壤杆菌属 （Agrobacterium）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、泛菌属（Pantoea）、甲基杆菌属（Methylobacterium）等[3]。用于内生菌研究的植物主要是药用植物[4]、经济作物[5-6]、瓜果[7-8]等，研究发现，内生细菌不仅能促进宿主植物的生长，增强宿主植物对环境变化的适应性[9-11]，还对植物病原菌有较好的抑制作用[12-13]。
　　《中药大辞典》记载，姜是重要的药食同源植物，具有消炎、散热、解毒等功效，研究发现姜中含有的姜精油、姜辣素及黄酮类化合物等化学成分具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖等作用[14]，还由于其独特的辛辣气味而作为调料品广泛应用于食物调味，具有重要的医用价值和经济价值。折溪‘小黄姜’（Zingiber officinale Roscoe）是六盘水折溪乡经过长期栽培选育出的优良栽培种，属于姜科姜属姜种。2000年经中科院地理科学与资源研究所鉴定，折溪‘小黄姜’为高品质生姜，其姜油含量为0.72%，姜辣素含量为2.85%，有机硒为1.20 mg·kg-1，其中姜油和姜辣素含量分别是国内其他品种姜的2～3倍[15]。目前对小黄姜的研究主要是栽培技术[16-17]和有效成分提取[18]，对内生菌的研究比较少。楚敏等[19]从生姜中分离得到23株内生细菌，分为5个属，周宁[20]从新鲜姜块中分离得到47株内生菌，并且发现内生菌对姜瘟病具有一定的抑制作用，但是关于折溪‘小黄姜’内生菌资源的研究未见报道。笔者以贵州省六盘水市六枝特区折溪乡‘小黄姜’为材料，对其内生菌进行分离、鉴定，为折溪乡‘小黄姜’内生菌资源的进一步研究提供理论依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　试验材料为取自贵州省六盘水市六枝特区折溪乡的折溪‘小黄姜’，折溪乡地处东经105°10'～105°15'，北纬26°05'～26°11'，海拔581～2 900 m，年平均气温和年平均降雨量适合小黄姜生长。试验于2018年10月在贵州大学农业生物工程研究院进行。
　　1.2 方法
　　1.2.1 内生细菌的分离 用水将材料表面的泥沙冲洗干净，置于阴凉处自然晾干。把姜组织块切成0.5 cm×0.5 cm的小块，用0.1%多菌灵溶液浸泡5 min，流水冲洗2 h，分别对其进行编号。在超净台进行表面消毒，先用75%的酒精震荡消毒5～7 min，无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞消毒5 min，无菌水冲洗3次，用无菌吸水纸吸干水分，放在超净台自然晾干。取100 μL最后一次冲洗的无菌水涂布在LB培养基上，设置3次重复，37 ℃倒置培养3 d，观察平板上是否有菌落出现，若没有则说明组织块表面消毒彻底，后续试验中分离得到的细菌均为内生细菌。 　　贵州省六枝特区种植大量‘小黄姜’，但是由于连作和无性繁殖等原因，‘小黄姜’体内积累大量的病毒病菌，影响其品质和口感[23]。廖震[24]利用sRNA 高通量序技术对贵州省六盘水市折溪乡的小黄姜进行了病毒预测，首次在小黄姜中发现一个杆状DNA病毒属的新病毒，命名为小黄姜杆状病毒（Zingiber bacilliform virus，ZBV） 。因此，内生菌对‘小黄姜’病原菌的抑制作用也是接下来重要的研究方向。芽孢杆菌属在生防菌中有非常大的应用前景[25-26]，傅俊范等[27]从土壤中分离出一株枯草芽孢杆菌，对人参锈腐病有较好的抑制作用，未见微小杆菌对植物病原菌抑菌作用的报道，但其对蓝藻具有促生作用[28]，还能够降解农药残留，修复环境污染[29]。陈政[30]的研究表明，肠杆菌属能够抑制姜瘟病病原菌的生长，陈涛[31]发现肠杆菌属是生姜内生菌的优势菌株。粘质沙雷氏菌产生的次生代谢物灵菌红素对烟草花叶病毒具有抑制作用，还能诱导寄主植物产生系统抗性（ISR）[32]。因此，笔者后续将针对分离的内生菌对‘小黄姜’的致病菌的抑制作用展开研究，以期找到‘小黄姜’的优良生防菌株。
　　另一方面，‘小黄姜’是典型的药食同源植物，内生菌与宿主植物共生，能够产生与宿主植物相同的药效[33-35]，有文献报道粘质沙雷氏菌产生的灵菌红素对癌细胞有抑制作用[36]。因此后续试验可对内生菌的活性成分进行研究，以期找到对人类健康有益的内生菌。
　　综上所述，笔者从折溪乡‘小黄姜’中分离得到5种内生细菌，属于2个科5个属，数量不多，但其所分离菌株的种属分布范围较大，为后期拮抗菌株的筛选和活性成分研究奠定了良好的理論基础。
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