Cep164基因对CP110在中心粒上表达的影响

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　　摘要：Cep164基因是参与纤毛形成的重要基因之一，为研究Cep164基因与CP110的关系，探讨CP110在Cep164调节纤毛形成中的作用，通过免疫荧光染色与Western印迹法确定Cep164基因缺失时CP110基因的表达情况，利用免疫共沉淀法确认Cep164与CP110蛋白相互作用的关系。结果表明，Cep164基因的缺失导致CP110表达增高，Cep164与CP110蛋白无直接相互作用关系，Cep164是通过间接方式调控CP110在细胞内表达，CP110降解失败可能为Cep164基因缺失导致纤毛生成障碍的原因之一。
　　关键词：Cep164基因;CP110基因;中心粒
　　中图分类号：Q132.7         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2020）02-0166-03
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.02.037           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　The Cep164 gene indirectly regulate CP110 expression in the centriole
　　WANG Chun-hua
　　（School of Life Science and Technology，Mudajiang Normal University，Mudanjiang 157000，Heilongjiang，China）
　　Abstract： Cep164 is one of the important genes involved in ciliogenesis. In order to study the relationship of the Cep164 and CP110， explored the role of CP110 in the regulation of ciliogenesis by Cep164. Immunofluorescence staining and Western Blotting were used to determine the expression of CP110 gene in the Cep164 gene knockout cell and embryo of mice. The interaction between the Cep164 and CP110 protein was confirmed by COIP. The results showed the Cep164 gene mutation increased CP110 gene expression. Cep164 regulated the expression of CP110 in cells indirectly. CP110 degradation failure could be the one of reason for the Cep164 gene mutation cause cilia dysfunction.
　　Key words： Cep164 gene; CP110 gene; centriole
　　Cep164是中心体激活元件Cep家族一员，位于母中心粒基体末端，参与纤毛的形成过程[1]。Moumita等[2]发现Cep164基因在纤毛相关肾消耗病患者中发生纯合子点突变。研究人员通过siRNA技术沉默细胞中Cep164基因证明了Cep164基因与纤毛形成过程中囊泡在母中心粒基体的定位有关，当Cep164基因突变时会导致细胞中纤毛缺失，但其参与纤毛形成的机制仍然不明确[3]。本研究在基因打靶法构建Cep164基因敲除鼠过程中发现Cep164基因完全缺失时小鼠将于E14.5 d前死亡[4]。E14.5 d前存活的Cep164-/-小鼠胚胎纤毛缺失，为确定Cep164基因缺失导致纤毛缺失的机制，对与纤毛形成附件蛋白进行间接免疫荧光染色评价，发现Cep164-/-小鼠胚胎细胞中纤毛形成appendage Ftm、Odf2、Cep290、Cep120、Ofd1和Ninein位置及表达量无明显变化，但CP110在母中心粒和子中心粒均表达的比例增多。有关报道显示CP110蛋白对中心粒的复制及纤毛的形成具有拮抗作用，CP110和Cep97可相互协调抑制纤毛轴丝的组装[5]。CP110能导致过长的中心粒现象，并且发现基因敲除后通过细胞饥饿法无法促进纤毛形成[5-8]。本研究通过间接免疫荧光染色与Western印迹法确定Cep164基因缺失时CP110的表达情况，利用免疫共沉淀法确认Cep164与CP110是否存在直接调节作用，探讨Cep164基因缺失导致小鼠胚胎纤毛缺失的机制。
　　1  材料與方法
　　1.1  试验动物
　　Cep164基因敲除杂合子小鼠（Cep164+/-）馈赠于美国康奈尔大学。
　　1.2  试验试剂
　　鼠抗兔Cep164，CP110（sigma，USA），γ-tubulin，a-tubulin（sigma，USA），间接荧光染色二抗CyTm3-conjugated Affinipure Goat Anti-mouse Ig G（H+L），Alexa Fluor 488-conjugated Affinipure Goat Anti-rabbit Ig G（H+L）（Jackon immuno research Co. USA），6孔、96孔细胞培养板（Costar，USA），100 mm细胞培养皿（Costar，USA）等。PLNCX2-FS-Cep164与PRK-myc-CP110质粒（馈赠于美国康奈尔大学）。 　　1.3  试验方法
　　1.3.1  Cep164基因缺失胚胎的制备  Cep164基因敲除杂合子雌鼠（Cep164+/-）与Cep164+/-雄鼠进行杂交，交配后雌鼠阴道栓出现记作交配成功，计算孕期，雌鼠怀孕8.5 d，断颈处死后，剥离胎鼠，通过基因型鉴定获得WT与Cep164-/-胚胎。
　　1.3.2  小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的分离培养与间接免疫荧光染色  根据原代细胞培养方法制备野生型（WT）与Cep164-/-胚胎MEFs，加入包备盖玻片的6孔板中培养48 h，甲醇溶液固定5 min，PBS溶液洗涤后，加入一抗混合液（γ-tubulin，CP110）100 μL，4 ℃孵育过夜。PBST溶液洗涤3次后，加入二抗100 μL（cyTm3抗鼠抗体1∶250，Alexa Fluor 488抗兔抗体1∶250）避光室温孵育1 h，DAPI染色液封片，观察拍照。
　　1.3.3  冰冻组织切片的制备与间接免疫荧光染色  WT与Cep164-/-胚胎于4%多聚甲醛中4 ℃固定1 h，30%蔗糖脱水，OCT包埋后制备切片（10 μm）。切片組织封闭液封闭后，加入一抗混合液4 ℃孵育过夜，加入二抗孵育1 h， DAPI染色液封片，观察拍照。
　　1.3.4  小鼠胚胎Cep164、CP110蛋白表达的测定  取Cep164-/-和WT胚胎加入300 μL RAPI裂解液制成匀浆，4 ℃下16 000 r/min离心30 min。取60 μg加入5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，转移至聚偏氟丙烯（PVDF）膜，5%脱脂牛奶封闭1 h后，分别加入1∶1 000稀释的一抗Cep164、CP110、a-tub，4 ℃孵育过夜。膜经PBST溶液漂洗后放于1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h。增强化学发光法（ECL）显色。暗盒冲洗胶片，扫描并用Quantity One软件分析试验结果。
　　1.3.5  免疫共沉淀法检测Cep164与CP110蛋白的关系  分别取PLNCX2-FS-Cep164与PRK-myc-CP110质粒1 μg加入2.5 mol/L的CaCl2溶液，2×HBS溶液各100 μL混匀。将混合液室温静置30 min后，逐滴均匀加入293细胞（每孔细胞密度达25%～30%）中。在标准生长条件下培养细胞，转染后8 h换培养液，72 h后每孔细胞加300 μL NP40裂解液4 ℃下16 000 r/min离心20 min，取上层液250 μL于40 μL Flag抗体-polyA-beads孵育2 h，洗涤后加入30 μL的1×loading Buffer溶液，37 ℃加热5 min，离心后取上层液上样，进行蛋白含量检测，方法同上。
　　2  结果与分析
　　2.1  Cep164基因敲除抑制CP110在细胞循环中的降解
　　如图1A所示，在WT与Cep164-/-细胞中心粒上均观察到CP110表达。计数统计细胞CP110表达比例，发现Cep164-/-细胞100%表达在两个中心粒，而WT细胞仅为66%，有34%的细胞CP110仅表达在一个中心粒上（图1B）。如图1C所示，Cep164-/-胚胎中的CP110蛋白的表达量高于WT，与图1A结果一致。由图1D发现，Cep164-/-胚胎神经管周围中心粒全部存在CP110表达，WT胚胎一些中心粒中无CP110表达（如箭头所示），Cep164-/-胚胎神经管中CP110表达密度高于WT胚胎，结果与图1B结果一致。Cep164基因影响了CP110在中心粒上的表达，这可能与Cep164基因的缺失阻碍了CP110在细胞循环上的降解有关，从而导致了CP110在Cep164-/-细胞中的高表达。
　　2.2  Cep164通过间接作用调控CP110在细胞循环中的降解
　　如图2A所示，CP110的两个表达点位于细胞核的中心粒上，每个表达点有两个点组成，Cep164位于细胞核上侧CP110表达点中的一个点上，说明Cep164在细胞中表达位置临近或位于CP110上。为证明Cep164是否与CP110直接作用，通过免疫共沉淀法检测发现，共转染FLNCX2-FS-Cep164与PRK-myc-CP110质粒细胞均表达Cep164与CP110蛋白，但通过Flag-bead拉下的蛋白中并未检测到CP110（图2B），说明Cep164与CP110蛋白无直接相互作用。
　　3  讨论
　　在前期基因打靶法构建Cep164基因敲除鼠过程中发现当Cep164基因完全缺失时纤毛缺失，与其他研究人员通过siRNA技术沉默细胞中Cep164基因的纤毛缺失表型一致[1]。研究通过细胞、组织间接免疫荧光染色与蛋白检测均证实Cep164基因缺失导致CP110在中心粒上的表达上调。CP110蛋白表达在中心体的两个中心粒上，是控制中心粒长度与纤毛形成的重要基体附件蛋白之一[9-11]，对纤毛的形成起到抑制作用，当细胞进入G0期间，母中心粒上CP110蛋白通过TTBK2介导降解，解除对纤毛形成的抑制[12]。本研究结果表明，CP110在Cep164基因缺失组中表达上调，而纤毛表达缺失，可能是Cep164基因敲除阻碍了CP110蛋白的降解过程，表现为Cep164-/-细胞中母细胞表达CP110比例增加。本研究对胚胎中CP110蛋白表达水平检测，Cep164/-胚胎中CP110蛋白表达高于WT胚胎，进一步说明Cep164基因突变抑制了CP110蛋白降解。在间接荧光染色图片上观察到CP110与Cep164在表达位置上有重叠，但由于间接荧光染色的局限性，不能确定Cep164直接或间接参与CP110蛋白的降解。本研究通过免疫共沉淀检测Cep164与CP110蛋白相互作用关系，结果发现Cep164与CP110蛋白无直接相互作用，说明Cep164基因通过间接方式参与CP110降解。Oda等[13]报道与TTBK2需与Cep164结合定位中心粒，参与纤毛形成过程。Cep164基因敲除导致CP110蛋白的降解失败，可能是由于G0期间，Cep164基因参与TTBK2蛋白募集到母中心粒上，Cep164基因敲除导致TTBK2蛋白募集失败，导致CP110在母中心粒上无法降解。 　　致谢：感谢康奈尔大学王宝林教授对本课题研究中的支持与帮助。
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　　收稿日期：2019-01-12
　　基金项目：黑龙江省普通本科高等学校青年创新人才培养计划;牡丹江师范学院青年创新人才培养项目（QC201601）;牡丹江师范学院博士
　　启动资金项目（MNUB201407）
　　作者简介：王春花（1984-），女，黑龙江牡丹江人，讲师，博士，主要从事药理与细胞生物学研究，（电话）13614631953（电子信箱）swxwch@126.com。
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