冬虫草子实体菌种提纯复壮技术研究
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作者: 杨柳平
摘要从野生冬虫草菌株中获取菌种，经人工驯化栽培，冬虫草（子实体）在生产实践中普遍出现传种几代后菌种严重退化的现象，通过菌种提纯复壮前后菌丝生长情况和子实体栽培情况的对比，结果证明不断对菌种进行提纯复壮，使菌种保持原有品种的遗传物质，恢复原来的生活力和优良种性，对防止菌种过早退化、保障子实体优质高产有一定的作用。
关键词冬虫草子实体；人工栽培；提纯复壮
中图分类号S567.35文献标识码A文章编号 1007-5739（2011）11-0154-01
2003年开始，梅州农业学校进行“冬虫草（子实体）人工栽培技术研究”课题研究并获得成功，2004年通过梅州市科技局组织的成果鉴定，并获2005年度梅州市科技进步三等奖。现在校内建立了规模化生产基地，取得了较好的经济效益和社会效益，但在生产过程中，遇到了一个普遍性的难题，就是容易出现菌种老化或衰退，造成产量和质量不稳定[1-4]。为了降低这种因菌种退化而带来的风险，笔者在菌种提纯复壮技术上进行了研究，现将结果总结如下。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1菌种。经栽培试验不断去劣择优以获得优良菌株。优良菌株的形态特征：菌丝生长快、洁白致密，后期转浅黄色，见光后易转桔黄色；在栽培中，选择原基分化早且整齐，子实体生长快、粗壮、抗杂菌能力强、耐高温、孢子多且呈桔黄色的作为优良菌株，同时作为待复壮的菌株。
1.1.2培养基配制。培养基中土豆200 g（煮汁）、蔗糖20 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁1 g、蛋白胨1 g、琼脂20 g，加水定溶至1 000 mL，经高压灭菌30 min。在24～25 ℃环境下制成斜面培养基。
1.2试验设计
试验设4个处理，分别为：孢子分离培养（A）；虫体回接法分离培养（B）；组织分离法培养（C）；未经复壮作为对照（CK）。
1.3试验实施
1.3.1无菌处理。所选待复壮优良菌株子实体，在无菌条件下经75%酒精和0.1%升汞溶液进行分离处理；分离所使用的工具要经过湿热灭菌、酒精擦抹、火焰灼烧等多种表面杀菌处理后，才可直接接触培养基、组织块。在21～25 ℃环境下静态培养，待菌丝布满斜面，再经考种，反复筛选，得到提纯复壮后的优良菌株。
1.3.2菌种分离培养。按试验设计采用以下3种分离方法：①孢子分离法。选取待复壮菌株的子实体，用0.1%升汞溶液，或75%酒精进行表面消毒后，用无菌水清洗表面药液，置于盛有综合培养基容器上方悬空，在21～23 ℃下静置培养，待培养基表面出现星芒状虫草菌落时[5-6]，在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基上培养。待蛹虫草菌丝布满斜面可得到菌种A。②虫体回接法。将蛹虫草通过活的蛹体进行复壮，将所选优良菌株的分生孢子，挑取一部分放在无菌水内制成孢子悬浊液，再选取发育时期的健康蚕蛹作宿主，用75%乙醇消毒，用接种针针尖蘸孢子悬浊液刺入蛹体，感染成功率可在95%以上，将染菌后的蛹体平摊于蚕匾或竹席上，24～25 ℃室温下保护至蛹体僵硬。取长满菌丝的体内组织粒到斜面培养基上，在24～25 ℃条件下继续培养到菌丝布满斜面，可得到优良菌种B。③组织分离法。在优良菌株中选取无杂菌的长度2～4 cm状态好的的子实体，用无菌水冲洗，刮掉表层，取肉质大小为1 mm于斜面培养基上，培养基斜面上应无游离冷凝水，以防细菌感染扩散，致使分离失败。在24～25 ℃培养15 d，菌丝布满斜面，得到菌种C。
1.3.3菌种的去污提纯。无论采用上述哪种菌种分离法，培养初期必须判断菌丝是否已受杂菌污染。分离培养后，若发现被有色的霉菌小斑点污染，最好放弃。如由同一材料分离得来的，每支试管都是如此，那就要重新分离。若污染点远离接种点，多是无菌操作中感染杂菌所致，可用前端菌丝切割法或基内菌丝挑取法转管提纯。严格地说，在斜面培养基上的非接种部位若见白色菌丝，则应认为是杂菌菌落，就应立即提纯，采用切割法或基内菌丝挑取法提纯后，一般都能获得较好的纯菌丝。
1.3.4考种。将经过不断提纯复壮后的3种菌种（处理A、处理B、处理C），分别置米饭培养基上，于18～23 ℃下培养20～30 d，观察生长情况。若见有细菌或霉菌污染，应进一步纯化；若无杂菌污染，子实体生长正常，说明菌种可靠，可继续扩大培养。
2结果与分析
由表1可知，经提纯复壮后的菌种处理A、处理B、处理C菌丝日平均生长量分别为5.75、6.12、5.15 mm，与未经复壮处理CK的菌种菌丝日平均生长量4.12 mm相比都有所提高，且子实体长势比较均匀、个数多；子实体栽培试验中复壮的菌种与未复壮处理的菌种子实体转色情况观察比较：处理B转色最快，处理C、处理A次之，未经复壮处理的CK转色最慢；从出草所需天数来看经复壮的菌种处理A、处理B、处理C出草天数分别为14、10、12 d，而未经复壮处理的CK出草天数为18 d，所需出草天数也缩短了；从产量上看，所采子实体重量也明显提高，从14.8 g/瓶分别提升到21.3、23.5、20.2 g/瓶。
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3结论与讨论
试验结果表明，提纯复壮的技术方法可以获得比较纯的优质菌种。但是虫草菌种要求的外界条件相当严格，受外界因素影响明显，如生产中菌种的移接代数、有效的菌种保藏方法、菌种生长营养条件和外界环境等，仅以常规提纯复壮的方法，还不能真正解决菌种衰退的问题。目前，有研究发现组织细胞产后的脱氢酶与细胞活力成正比，因此也可以通过脱氢酶的测定来提早淘汰退化菌株，以减少损失。
4参考文献
[1] 李亚洁，王鹤，孟楠，等.蛹虫草菌种复壮技术的研究[J].食用菌，2006，28（2）：18-19.
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[4] 王家斌.双孢蘑菇多孢子分离试验[J].食用菌，2005，27（2）：16.
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[6] 黄毅.食用菌栽培[M].北京：高等教育出版社，2009.
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