猪源乳酸杆菌的分离鉴定及其发酵培养条件优化

来源:用户上传      作者: 韩亚超 王明跃

　　摘要微生态制剂是发展绿色养猪业的关键，乳酸杆菌是目前应用的微生态制剂中最重要的有益菌组成成分之一。分离、鉴定并筛选出1株耐酸和耐胆盐能力较强的乳酸杆菌，命名为乳酸杆菌L5株。采用单因素法和正交试验设计法对其发酵培养条件进行了优化，发酵培养菌落总数可达8.25×108 cfu/mL。
　　关键词猪源乳酸杆菌；分离鉴定；发酵条件；优化
　　中图分类号S852.6文献标识码A文章编号 1007-5739（2011）11-0332-02
　　
　　IsolationandIdentificationofLactobacillusfromSwineandOptimizationofCultureConditions
　　HAN Ya-chaoWANG Ming-yue
　　（Fuyang Vocational-technical College，Fuyang Anhui 236031）
　　AbstractProbiotics is the key to developing green pig industry. Lactobacillus is one of the most important beneficial bacterium components in the current application probiotics. One Lactobacillus strain which had strong acid and bile salts resistance was isolated，and it was identified and named Lactobacillus strain L5. The fermentation conditions in liquid culture were studied by single factor test and orthogonal test. Under optimal conditions，the living bacteria concentration reached 8.25×108 cfu/mL in the fermentation liquid.
　　Key wordsLactobacillus from swine；isolation and identification；fermentation condition；optimization
　　
　　由于长期大量使用抗生素和化学药物的弊端日益明显，使得微生态制剂在畜牧养殖业的应用成为必然。微生态制剂进入肠道可以通过与肠道有害菌群的竞争占位、夺氧等竞争性抑制或分泌抗性物质、酶和有机酸等作用使得肠道内有益菌群成为优势种群，进而调整肠道微生态平衡，达到有利于消化、健康的作用。因此，在仔猪饲料中添加微生态制剂，可明显降低仔猪肠道疾病的发病率、提高仔猪成活率和生长率[1]。
　　我国是养猪大国，微生态制剂的应用是发展绿色养猪业的关键。目前微生态制剂应用较多的主要有乳酸菌类制剂、芽孢杆菌类制剂、双歧杆菌类制剂、光合细菌类制剂和真菌类制剂等。其中，乳酸杆菌（Lactobacillus）在肠道中生长繁殖，抑制有害菌生长，是动物机体内正常的生理菌群之一。乳酸杆菌能够合成共轭亚油酸（Conjugated linoleicacid，CLA），产生乙酸和乳酸，降低肠道pH值，从而提高动物的免疫力和生产性能[2]；此外，乳酸杆菌一方面可刺激肠道局部的免疫反应，另一方面通过粘附于肠道黏膜细胞上，而对肠道黏膜产生占位性保护作用。笔者从健康仔猪的肠道中分离有益的乳酸杆菌，并进行了其发酵培养基和培养条件的优化研究，为进一步研制猪用微生态制剂奠定基础。现将研究结果报告如下。
　　1材料与方法
　　1.1试验材料
　　供试材料：取健康的15日龄长白猪仔猪小肠黏膜。供试培养基：供试基础培养基，即乳酸杆菌选择性培养基，按照陈天寿[3]的方法进行配制；生化培养基按照赵斌等[4]的方法配制。试验试剂：试验所使用的各种试剂均按照赵斌等[4]的方法配制。
　　1.2试验方法
　　1.2.1 乳酸杆菌分离。将健康的15日龄仔猪麻醉处死，通过无菌操作刮取1 g小肠黏膜，经适当稀释后涂布在MRS琼脂平板上，于 37 ℃厌氧条件下培养48 h。挑取颜色、大小、形状、边缘、分布位置各异的单菌落，在MRS琼脂培养基上划线得到纯培养。通过革兰氏染色镜检，挑选染色结果为革兰氏阳性、不产芽孢的杆状菌株，以备后续试验用。
　　1.2.2乳酸杆菌鉴定。将挑选出来的菌种依次从形态、理化特性、代谢产酸等方面按《伯杰氏细菌鉴定手册》（第8版）进行鉴定[5]。
　　1.2.3乳酸杆菌耐酸性试验。菌液接种于MRS培养液中，其pH值分别为2.0、3.0、4.0、6.8（对照），并在37 ℃条件下分别处理1、2、3 h，通过保温前后活菌计数结果计算细菌存活率。
　　1.2.4乳酸杆菌胆盐耐受性试验。菌液接种于胆盐浓度分别为0（对照）、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%的MRS培养液中，在37 ℃条件下处理3 h后，平板菌落计数，筛选出对酸和胆盐耐受能力均较强的菌株进行后续的试验。
　　1.2.5乳酸杆菌生长曲线测定。将保存的菌种用MRS液体培养基活化。将活化的菌种以5%（v/v）的接种量接入MRS液体培养基，37 ℃培养48 h，其中每隔2 h取样1次测定菌液的OD值（600 nm）和pH值，用未接种的培养液作空白对照。
　　1.2.6发酵培养基营养成分的确定。在MRS液体培养基的基础上，分别添加2%葡萄糖、红糖、蔗糖作为不同的碳源；分别加入1%胰蛋白胨、大豆蛋白胨和鱼肉蛋白胨作为不同的氮源；分别加入0.5% K2HPO4和KH2PO4、β-磷酸甘油二钠以及Na2HPO4和NaH2PO4作为不同的磷源；分别加入0.5%牛肉膏、酵母膏和10%（v/v）玉米浆作为增菌因子，其他组分不变。菌种以5%（v/v）接种量，初始pH 值为6.0，在37 ℃下培养24 h。采用平板菌落法计数，每个处理3次重复，取平均值，以确定乳杆菌L5株发酵培养基营养成分的种类。
　　1.2.7发酵培养条件的优化。选择温度分别为33、38、43 ℃，初始pH值分别为5.0、6.0、7.0，发酵时间分别为18、22、26 h，设计正交试验（L934）用于优化发酵培养条件。
　　1.2.8培养基营养成分的优化。按照1.2.7的试验结果安排培养条件，改变碳源、氮源、增菌因子、磷源的含量，设计正交试验（L934）用于优化培养基的营养成分。
　　2结果与分析
　　2.1乳酸杆菌分离和菌落形态
　　经厌氧培养48 h后，从MRS平板上分离得到菌株62株，经染色镜检，从中筛选出无芽孢杆菌、革兰氏阳性12株，分别编号为L1~L12。其菌落特征为直径0.5~2.0 mm，菌体杆状、圆形、乳白色、表面光滑凸起、边缘整齐，多排列成长短不一的链状，也有单个分散排列。
　　2.2乳酸杆菌的生理生化鉴定结果

　　乳酸杆菌的鉴定结果如下：菌株L1～L12的运动性、接触酶、硝酸盐还原、明胶液化、产生吲哚、硫化氢、V-P试验鉴定结果均为阴性，代谢产酸为a.L（L型乳酸）。根据《伯杰细菌鉴定手册》，判定所选的12株菌株为乳酸杆菌（Lactobacillus）。
　　2.3乳酸杆菌的耐酸及耐胆盐筛选试验结果
　　乳酸杆菌的耐酸筛选试验结果见表1。根据表1的统计结果，挑选在pH值为2.0、耐受2~3 h条件下，耐酸性较强的菌株L1、L2、L5、L6、L11进行了耐胆盐筛选试验。乳酸杆菌的耐胆盐试验结果见表2。由表2可知，胆盐明显抑制乳酸杆菌的生长，并且随着胆盐浓度升高，各乳酸杆菌存活数均明显下降。综合各菌株对酸和胆盐的耐受情况，选择L5菌株进行后续试验。
　　2.4乳酸杆菌生长曲线的测定
　　乳酸杆菌L5培养过程中的生长趋势和培养基pH值的变化见图1。由图1可知，在乳酸杆菌L5接种后OD值逐渐上升，10 h后上升速度较快，进入对数增长期；在接种18~20 h后，OD值上升速度开始减慢，即菌体进入稳定生长期。培养基的pH值在最初6~8 h内变化较小，10 h后迅速下降，18~20 h后达到最低，说明菌株产酸能力与其生长期基本保持一致。
　　2.5液体发酵培养基营养成分的确定
　　通过试验，确定乳杆菌L5株液体发酵培养基最佳碳源是红糖，最佳氮源是胰蛋白胨，最佳磷源是β-磷酸甘油二钠，最佳增菌因子是酵母膏。
　　2.6发酵培养条件的优化
　　优化发酵培养条件的正交试验设计方案及结果见表3。由表3可知，3个因素对乳酸杆菌L5株增殖的影响顺序为：温度＞时间＞初始pH值。优化的最佳发酵条件为：培养温度为38 ℃，培养时间为26 h，初始pH值为5.0。
　　2.7发酵培养基营养成分含量的优化
　　发酵培养基营养成分含量的优化设计方案及结果见表4。由表4可知，各营养因素对乳酸杆菌L5菌株液体发酵培（上接第333页）
　　养效果的影响顺序是：红糖＞胰蛋白胨＞酵母膏＞β-磷酸甘油二钠。这几种营养因素的最佳组合应是2%红糖、1.5%胰蛋白胨、0.4%酵母膏和0.5% β-磷酸甘油二钠。
　　3结论与讨论
　　本研究直接从健康的仔猪肠道中进行乳酸杆菌的分离，因为益生菌的菌株具有较强的针对性和特异性，在其被制作成活菌制剂后也有一定的专一性[6]。由于乳酸杆菌对环境的抗性较差，不产芽孢，不易通过胆汁和胃酸环境，因此模拟了宿主体内低pH值、高胆盐浓度的环境，进行乳酸杆菌的筛选，从而筛选出了具有较强抗逆性的菌株L5。活菌含量决定了微生态制剂是否有效以及作用效力的大小。系统地研究了获得最大活菌数的条件，对乳酸杆菌L5株的培养基和培养条件进行了优化，结果表明，其最佳液体发酵培养基组成为2%红糖、0.4%酵母膏、1.5%胰蛋白胨和0.5% β-磷酸甘油二钠、0.2%柠檬酸铵、0.5%乙酸钠、0.1% L-Cys盐酸盐、0.1%吐温-80、0.02% MnSO4、0.05% MgSO4，在初始pH值5.0、38 ℃下培养26 h，菌落总数可达8.25×108 cfu/mL。
　　4参考文献
　　[1] 何明清，倪学勤.我国动物微生态制剂研究、开发和应用动态[J].饲料广角，2002（21）：1-7.
　　[2] JULIA B E，JOHN W W，HUGO D，et al.Bioproduction of Conjugated Linoleic Acid by ProbioticBacteria Occurs In Vitro and In Vivo in Mice[J].A-merican Society for Nutrition J Nutr，1996（136）：1483-1487.
　　[3] 陈天寿.微生物培养基的制造与应用[M].北京：中国农业出版社，1995：33-34.
　　[4] 赵斌，何绍江.微生物学实验[M].北京：科学出版社，2002：143-159.
　　[5] R E布坝南，N E吉本斯.伯杰细菌鉴定手册[M].中国科学院微生物研究所《伯杰氏细菌鉴定手册》翻译组，译.北京：科学出版社，1984：793-820.
　　[6] 孙宪文.猪源乳酸杆菌对仔猪肠道微生物的影响[J].农业与技术，2008，28（2）：71-73.
　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文

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