猪粪便沼液中多种抗生素残留量的LC—MSMS检测

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　　摘要：采用固相萃取-超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法同时检测猪粪便、尿液和沼液中磺胺二甲嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪、恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、单诺沙星、红霉素等12种抗生素，优化了前处理和分离检测条件，12种目标物在10 min内完成分析，在质量浓度1.00～ 100 μg/L范围内线性良好，方法检出限为0.05～3.00 ng/mL，实际水样加标回收率为62.5%～105.2%。
　　关键词：抗生素；粪便；沼液；固相萃取；超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法
　　中图分类号：TS254 文献标志码：A doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2019.03.045
　　Determination of Residual Antibiotics in Pig Manure and
　　Biogas Slurry by LC-MSMS
　　WANG Guangjie，XU Li'na，YANG Ling，JIANG Jielu，LI Jun，QU Jiejing
　　（Shandong Tongji Testing Technology Co.，Ltd.，Yantai，Shandong 264004，China）
　　Abstract：Simultaneous determination of pig feces，urine and biogas slurry by solid phase extraction ultra performance liquid chromatography with three heavy four stage mass spectrometry sulfamethazine，sulfa-chloropyridazine etc. twelve antibiotics. The pretreatment and separation detection conditions were optimized. Twelve targets were analyzed within 10 minutes. The linearity of the method was good in the range of 1.00～100 μg/L. The detection limit was 0.05～3.00 ng/mL. The recoveries of the actual water samples was 62.5%～105.2%.
　　Key words：antibiotics；feces；biogas liquid；solid phase extraction；LC-MSMS
　　在最近几十年中，兽用抗生素使用量惊人，大量的饲用抗生素作为饲料添加剂长期使用，动物经排泄进入粪便、沼液中，造成药物残留和耐药基因的产生，包括动物致病菌和内在微生物菌群，进而对人类染病的医治和微生态环境构成潜在威胁，同时兽用抗生素在肉、蛋、乳等动物产品中残留通过一般的食品烹饪方法不能完全使其分解，从而对人产生毒副作用和耐药性。
　　据研究报道，对可食用动物使用的抗生素有25%～75%以母体药物的形式从粪尿中排出体外，并且在土壤中长期滞留[1]。有相当比例的兽药抗生素以母体药物或代谢产物的形式通过禽畜粪尿进入水体和土壤中，从而对环境造成了潜在威胁。
　　目前，抗生素的含量测定方法有微生物法、高效毛细管区带电泳法、薄层色谱法、酶联免疫法及高效液相色谱法[2-3]等。试验选择独特的样品处理方法，建立了一种快速、准确、分离度好的高效液相色谱质谱法。
　　1 材料与方法
　　1.1 主要仪器
　　Waters H-class型与AB SCIEX API 4000 Plus型液相色谱质谱联用仪，配有电喷雾离子源（ESI源）；SPE固相萃取装置；氮吹仪；分析天平：感量分别 为0.001 g和0.000 01 g；高速冷冻离心机：转速≥10 000 r/min；冷冻干燥机等。
　　1.2 主要试剂耗材
　　标准物质均为有证标准物质，购于坛墨质检、Sigma等，纯度≥98%；乙腈（色谱纯），德国Merck公司提供；EDTA（分析纯），国药集团化学试剂有限公司提供；其他试剂均为分析纯；试验用水为蒸馏水或去离子水；HLB固相萃取柱（200 g/6 L），美国Waters公司提供。
　　1.3 仪器分析条件
　　1.3.1 色谱条件
　　色谱柱为BEH C18型（1.7 μm，2.1 mm×50 mm），柱温40 ℃，进样体积5 μL；流动相：A为0.1%甲酸水，B为乙腈；流速0.3 mL/min。
　　梯度洗脱程序见表1。
　　1.3.2 质谱条件
　　電离方式采用电喷雾离子源正离子模式（ESI+），多反应监测（MRM）检测，雾化气为N2。
　　6种抗生素主要质谱参数见表2。
　　1.4 样品分析步骤
　　1.4.1 试样制备
　　样品采自当地个体养猪场粪便水，静置后取上层尿液和沼液的水样加入3 g Na2EDTA，调节pH值至3～4后过小柱，过柱后若水样较为浑浊或悬浮杂质较多应过滤处理，水样采集后3 d内完成检测。
　　下层粪便经-60 ℃冻干，准确称取0.2 g干燥脱水样品于10 mL离心管中，加入10 mL 50%的1 mmol/L EDTA甲醇溶液（pH值2），涡旋混匀1 min，超声10 min后，以转速4 000 r/min离心5 min，转移上清液，再重复萃取2次，合并所有上清液，摇匀。
　　1.4.2 净化浓缩 　　HLB固相萃取小柱依次用6 mL二氯甲烷、6 mL甲醇、6 mL Na2EDTA溶液活化，合并提取后水样以1～2 mL/min流速过柱，富集完成后用10 mL水淋洗，氮吹20 min，用10 mL 3%氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，氮吹至近干后用1 mL初始流动相定容，过0.2 μm有机滤膜后进样分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 标准品色谱图
　　12种抗生素MRM扫描質谱图见图1。
　　12种标准物质保留时间分别为3.09，3.48，1.60， 3.25，2.00，3.24，3.26，2.99，3.14，3.01，3.22， 3.63 min。在猪粪便、猪尿和沼液水样中分别添加12种药物，以10倍信噪比（S/N）计算，在进样量10 μL时，得到此方法最低检测质量浓度为0.05～3.00 ng/mL。
　　2.2 工作曲线
　　将12种标准物质稀释至1～100 μg/L，按上述仪器条件进行分析，以定量离子对的相应峰面积和对应质量浓度进行线性回归得到标准曲线。
　　12种抗生素线性回归曲线及检出限见表3。
　　2.3 实际样品分析
　　在猪粪便、猪尿和沼液水样中添加10 ng/mL的标准溶液进行加标回收，采用外标法定量，结果显示12种标准物质在水样中的回收率为62.5%～105.2%。
　　12种抗生素加标回收率见表4。
　　3 结论
　　建立了多种抗生素一次处理进样快速有效的检测方法，在实际样品猪粪便、猪尿和沼液水样中添加多种抗生素平均回收率为62.5%～105.2%。该法具有快速、稳定、灵敏、高效等特点，适用于环保行业对多种抗生素的检测，可广泛推广于企业作为常规检测的方法。
　　参考文献：
　　李兆君，姚志鹏，张杰，等. 兽用抗生素在土壤环境中的行为及其生态毒理效应研究进展[J]. 生态毒理学报，2008（1）：15-20.
　　胡莹莹，李爱，叶赛，等. 高效液相色谱与酶联免疫试剂盒测试海水中痕量氯霉素[J]. 分析试验室，2006， 25（3）：112-114.
　　蔡玉娥，蔡亚岐，牟世芬，等. 亲水性C16硅胶反相色谱柱分离测定芳香胺类化合物[J]. 分析化学，2006， 34（6）：745-748. ◇
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