玉米染色体滴片关键技术及其优化

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　　摘要：探讨优化玉米染色体滴片关键因子处理效果，寻求一种操作简单、染色体分散度和完整性好，并且适于玉米染色体分离操作的制片方法。本研究以玉米自交系B73根尖为材料，在单因素试验的基础上采用四因素二次回归正交组合设计，分析玉米滴片技术中4个关键因子的处理效果。结果表明，N2O处理时间、冰乙酸固定时间、酶解时间和滴片距离对染色体滴片效果均存在最佳处理效应。基于二次回归方程的统计方法得到了符合实际的优化的染色体滴片技术方案，即采用N2O处理时间2.0h、冰乙酸固定时间2.0h、酶解时间6.0h和滴片距离35.0cm。由此方案制作了高质量的玉米染色体制片，保证了细胞中染色体的分散性和完整性。
　　关键词：玉米;染色体;滴片;优化
　　中图分类号：S513
　　文献标识码：A
　　文章编号：1000-4440（2019）02-0255-07
　　染色体作为基因的载体，一直是细胞遗传学和分子生物学研究的热点。染色体制片是观察、鉴定染色体的基本方法，它是进行生物染色体组型分析、染色体显带、染色体畸变分析、染色体特殊成分鉴定、DNA原位杂交和单染色体分离研究的重要技术手段。传统的染色体制片技术是压片法和火焰干燥法，众多学者就染色体制片过程中的取材时间、预处理方式、冰乙酸固定时间、细胞解离及染色方法等作了大量卓有成效的研究。潘颀等以新疆紫草为材料，用压片法研究染色体制片技术，其研究结果表明，新疆紫草染色体制片效果主要取决于秋水仙素预处理时间、处理温度和细胞解离时间3个关键处理因子。劳世辉等采用火焰干燥法制备菠萝蜜染色体制片，通过比较不同预处理试剂和预处理时间的作用效果，发现以1：1（体积比）的8-羟基喹啉（0.002mol/L）与秋水仙素（0.2%）混合液预处理制片材料，可达到理想的染色体制片效果。陈雪等通过对射干染色体压片技术研究指出，室温下用秋水仙素（0.1%）预处理材料8h和379C下酶解材料60min，用压片法可制作出染色体分散良好的制片。刘丹等通过比较分析多种植物的染色体压片技术，认为压片法中制约植物染色体制片效果的关键处理因子是预处理药剂和时间。分子生物技术的发展对染色体制片技术提出新的更高的要求，一张高质量的染色体制片要求处于有丝分裂中期相的细胞多，染色体交叉重叠少、分散性好，细胞内容物少、清晰度高。染色体滴片法是新兴的一种染色体制片方法，目前国内鲜见有关染色体滴片技术研究的相关报道。为此，本试验以遗传学研究的模式生物一玉米为染色体制片材料，采用数理统计法分析影响染色体滴片效果的4个关键因子，为规范玉米染色体滴片技术提供理论依据。
　　 1 材料与方法
　　 1.1 试验材料
　　选用典型玉米自交系B73作染色体制片材料，玉米自交系B73种子由长江师范学院玉米育种课题组提供。
　　 1.2 试验方法
　　 1.2.1 染色体滴片制作
　　 1.2.1.1 胚根在培养皿内铺一层无菌纱布，放入预浸6h的玉米种子，在恒温培养箱内25C培养1～2d，待胚根长1.0～2.0cm时，剪取1.0～1.5cm根尖置入盛有超纯水的EP管中，让湿润根尖贴于管壁。1.2.1.2 N2O处理将装有根尖的EP管放入N2O处理罐，在0.5Pa的压强下进行N2O处理，N2O处理罐由解压阀、N2O罐、连接管、处理罐和三通阀组成。
　　 1.2.1.3 冰乙酸固定取出EP管并滴加适量90%冰乙酸对根尖材料进行固定处理。
　　 1.2.1.4 材料漂洗固定后的根尖材料从EP管取出，在盛有超纯水的培养皿中漂洗2～3次，然后置于载玻片切取根尖分生区。
　　 1.2.1.5 制备细胞悬液根尖分生区材料在37C温度下酶解，酶解后的材料用70%乙醇清洗2次，再置入瞬时离心机离心2次，每次8s，最后加入冰乙酸，捣碎混匀制成细胞悬液。
　　 1.2.1.6 细胞悬液滴片用移液枪吸10μl细胞悬液，在一定高度依靠其自身重力直接滴加在载玻片上，待滴液干燥后进行染色处理。
　　 1.2.1.7 镜检在光学显微镜下观察、鉴定滴片中细胞有丝分裂中期染色体，并利用照像系统进行拍照记录。
　　 1.2.2 制订染色体制片评分标准以染色体滴片效果为考察指标，根据有丝分裂中期相的细胞数、染色体重叠率、单细胞染色体数和细胞内溶物面积比4个参数值，对染色体滴片效果进行评定等级，其评分标准见表1。
　　 1.2.3 试验设计基于前期大量的玉米染色体滴片试验，单因素试验设计参照贾建的方法，按不同的试验设计，选择不同的N2O处理时间（1.0h、1.5h、2.0h、2.5h和3.0h）、冰乙酸固定时间（1.0h、1.5h、2.0h、2.5h和3.0h）、酶解时间（5.0h、5.5h、6.0h、6.5h和7.0h）和滴片距离（10.0cm、20.0cm、30.0cm、40.0cm和50.0cm）。用二次回归正交组合设计分析染色体滴片效果与各关键因子间的线性关系。单因素试验设计得到的最优处理作为二次回归正交设计的零水平，进行回归正交试验，建立染色体滴片效果与各关键因子的回归方程，以探究玉米染色体滴片法的最佳技术方案。
　　 1.3 数据分析
　　试验数据经Excel整理后，利用DPS软件进行二次回归正交组合设计统计分析，建立回归方程。
　　 2 结果与分析
　　 2.1 各关键因子对染色体滴片的處理效果
　　由表2可知，N2O处理时间分别为1.0h、1.5h、2.0h、2.5h和3.0h时，玉米染色体滴片效果的得分等级分别为1、2、5、4和3，以2.0hN2O处理时间的评分等级最高，染色体滴片效果最好（图1a3）。冰乙酸固定根尖材料时间分别为1.0h、1.5h、2.0h、2.5h和3.0h时，其滴片效果的得分等级分别为1、2.5、4和3，以2.0h固定时间的染色体滴片效果最好（图1b3），评分等级最高。酶解时间分别为5.0h、5.5h、6.0h、6.5h和7.0h时，其滴片效果的得分等级分别为3、4、5、2和1，以酶解时间为6.0h的染色体滴片效果最好（图1c4），评分等级最高。滴片距离分别为10.0cm、20.0cm、30.0cm、40.0cm和50.0em时，其滴片效果的得分等级分别为1、3、5、4和2，以30.0cm距离的染色体滴片效果最好（图1d3），评分等级最高。 　　 2.2 二次回归正交设计及回归分析
　　据单因素试验结果，二次回归正交组合设计零水平分别为2.0h、2.0h、6.0h和30.0cm。关键处理因子N2O处理时间的上下水平分别为1.0h和3.0h，冰乙酸固定时间的上下水平分别为1.0h和3.0h，酶解时间的上下水平分别为5.0h和7.0h，滴片距离的上下水平分别为10.0cm和50.0cm。由m=4、m，=3，选用γ=1.547，设计4个因素：N2O处理时间（Z）、冰乙酸固定时间（Z2）、酶解时间（Z3）和滴片距离（Z4），相应编码为x1、x2、x3和x4，列出因素水平编码表（表3），将试验设计中的编码水平转换成相应的实际水平，即得试验实施方案（表4）。
　　据四因素二次回归正交组合设计表，整理数据后得到四因素二次回归正交组合设计结构矩阵及试验结果计算表（表5），由此建立回归方程：Y=6.18-0.25x1+0.12x2-0.29x3+0.19x4-0.30x1x2+0.10x1x3+0.06x1x4+0.29x2x3-0.03x2x4-0.13x3x4-1.47x’1-1.41x'2-1.45x'3-1.20x'4。
　　據表6显著性检验结果，x1、x2、x3和x4，的二次项均达到极显著水平，其余各项回归系数均不显著，说明x1、x2、x3和x4的二次项对试验结果有极显著影响，回归关系极显著，由此建立的数学模型与实际情况拟合较好。据平方项中心化公式：x’j=xj2-（xj20）/n=xj2-0.77，得到回归方程：Y=10.44-0.25x1+0.12x2-0.29x3+0.19x4-0.30x1x2+0.10x1x3+0.06x1x4+0.29x2x3-0.03x2x4-0.13x3x4-1.47x12-1.41x22-1.45x32-l.20x42。以Y值最大为目标函数，通过确定参数xj（j=1，2，3，4）的最优值。当Y值最大时，据目标函数解得x1=-0.078，x2=0.040，x3=-0.110，x4=0.360，将x=（Z1-2）/0.65，x2=（Z2-2）/0.65，x3=（Z3-6）/0.65，x4=（Z4-30）/12.93代入得到实际因素Z1=1.95，Z2=2.04，Z3=5.93，Z4=34.65
　　综上所述，根据回归方程，优选出各关键处理因子的最佳方案，基于试验操作的实际性，采用取整法，即得到本试验玉米染色体滴片法关键处理因子的最佳技术方案：N2O处理时间2.0h，冰乙酸固定时间2.0h，酶解时间6.0h，滴片距离35.0cm。
　　 3 讨论
　　 3.1 影响染色体滴片效果的主要因素
　　滴片法的操作步骤有取材、预处理、固定、解离和滴片。材料预处理的目的是改变细胞内染色体形态及分散状态，常采用秋水仙素、8-羟基喹啉和a-溴萘等药剂进行化学处理，本研究对材料的预处理则是通过增压条件下的N2O处理达到改良细胞内染色体状态的目的，同时避免了秋水仙素等化学试剂带来的毒害和污染。材料固定的目的是使材料快速失活和蛋白质沉淀，使材料保持初始状态，卡诺氏I固定液和甲醇冰乙酸（1：3，体积比）混合液是常用的固定液，固定液固定时间是影响染色体压片技术的因素之一，本试验选择冰乙酸固定材料2h，取得了较好的效果。解离是植物染色体制片过程的重要环节，解离能分解细胞壁，消除细胞内溶物，增加染色体清晰度，解离方法有酸解法和酶解法，酸解法往往因酸解过度造成染色体损伤，目前多采用酶解法，对于酶解时间，回归分析选优结果表明，采用2%纤维素酶和0.5%果胶酶混合液37C下酶解材料6.0h最适宜滴片法制片。不同于压片法和火焰干燥法，滴片法的制片质量取决于滴片技术，而滴片距离直接决定染色体制片的成败，滴片距离过小，细胞内染色体交叉重叠、分散性差，滴片距离过大则细胞内染色体过度分散、细胞间染色体混杂，回归分析选优结果发现，细胞悬液以35.0cm的距离滴片可获得分散性好、细胞内染色体数目完整的高质量制片。滴片法常规试验中多采用20.0cm左右的滴片距离，35.0em的滴片距离在实际操作中可能存在滴片不准、细胞悬浮液流向边缘导致浪费等问题。因此，在实际的试验操作中，需综合考虑，或反复进行滴片技术的训练，以达到最佳的制片效果。 　　 3.2 植物染色体制片技术
　　染色体制片质量是制约细胞生物学和分子生物学发展的重要因素，一张高质量的染色体制片要求细胞有丝分裂中期相多、染色体分散无重叠及染色体完整性好。目前国内外通常采用压片法和低渗涂片法進行染色体制片。染色体压片技术作为常用的染色体制片方法，被广泛应用于各类生物，尤其是植物染色体研究。压片法虽然操作简单实用，但需要适宜的取材时间和娴熟的压片技术，对操作者的操作技术要求较高。染色体低渗涂片技术的核心是将试验材料均匀涂布在载玻片，上，从而有效降低压片法所造成的染色体重叠。低渗涂片法尽管对操作技术要求不高，且制片效果较好，但其操作过程涉及火焰干燥和盖玻片压片，从而影响染色体完整性。染色体滴片法是将处理后的试验材料捣碎于冰醋酸溶液，然后制成细胞悬液，细胞悬液利用自身重力滴落在玻片上，保证了细胞中染色体的分散性和完整性。滴片法是一种新的染色体制片方法，目前国内尚未见有关滴片技术研究的相关报道，鉴于滴片法的技术优势，它将广泛应用于染色体研究，进而促进细胞遗传学和分子生物学的发展。为规范染色体滴片技术，本研究基于前期的染色体滴片技术经验，通过设置染色体滴片技术关键处理因子，采用回归分析模型，确立了最佳玉米染色体滴片技术方案。由此制作了高质量的染色体制片，制片中细胞有丝分裂中期相多、细胞内溶物和杂质少、染色体着色均匀、染色体交叉重叠少、具有完整染色体组（2n=20）的细胞较多。
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