斑马鱼石蜡组织切片技术的优化
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摘 要：为优化斑马鱼（Danio rerio）石蜡切片制作技术，以斑马鱼心、肠、肝脏为材料，研究了斑马鱼石蜡组织的切片制作方法，并采集图像进行分析。结果表明，改进后的实验方法能够制作出高质量的斑马鱼石蜡组织切片。
关键词：斑马鱼;石蜡切片;苏木精-伊红染色;心脏
中图分类号 Q95-3 文獻标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）09-0067-2
Abstract：To optimize the paraffin slicing technology of zebrafish （Danio rerio），Using zebrafish heart，intestine and liver as materials，the method of making paraffin tissue sections of zebrafish was studied，and image analysis was collected.The results showed the improved experimental method can produce high quality paraffin tissue sections of zebrafish.
Keywords：Zebrafish;Paraffin section;Hematoxylin-eosin staining;Heart
斑马鱼（Danio rerio）又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼，隶属辐鳍亚纲鲤科短担尼鱼属，是一种重要的脊椎动物模型，广泛应用于发育生物学、遗传学以及毒理学等多个研究领域[1-2]。目前，国内外关于斑马鱼正常组织结构的研究还较少，主要是关于斑马鱼端脑、中脑和肠道的组织结构的研究[3-5]，因而斑马鱼的组织结构基础资料亟待完善。
石蜡组织切片能够清晰显示组织细胞的形态结构，提供基础组织的形态学资料[6]。但是石蜡切片的制作步骤繁杂，影响因素多，因而摸索出一套制作高质量斑马鱼石蜡切片的方法尤为重要。本实验以斑马鱼心、肠和肝脏为实验材料，拟从浸蜡和染色步骤着手改进斑马鱼石蜡切片制作技术，以期为斑马鱼的组织学研究提供理论依据。
1 材料
1.1 实验材料 健康成年斑马鱼15尾，体长平均为（3.0±0.2）cm。
1.2 试剂与仪器 苏木精（南京奥多福尼生物科技有限公司），伊红（Y水溶，天津市大茂化学试剂厂），乙醇（分析纯，南京华嘉化学试剂有限公司），二甲苯（分析纯，广州迪鑫多科学仪器有限公司）。2508型切片机（上海珂淮仪器有限公司），徕卡体视显微镜、徕卡DMI3000B型倒置荧光显微镜（上海立光精密仪器有限公司）。溶液配方：埃利希（Ehrlich）苏木精（苏木精1.0g、十二水硫酸铝钾2.5g、甘油50mL、无水酒精50mL、蒸馏水50mL、冰醋酸5mL）;磷钨酸苏木精（苏木精0.1g，磷钨酸2g，蒸馏水100mL）;中性甲醛溶液（40%甲醛50mL、无水磷酸氢二钠3.25g、磷酸二氢钠2.0g、蒸馏水450mL）。
2 实验方法
2.1 取材 迅速在体视显微镜下解剖斑马鱼，取出器官后生理盐水清洗2～3次，然后在中性甲醛溶液固定约24h。
2.2 石蜡切片制作
2.2.1 常规方法 将组织于70%乙醇分别冲洗3次，脱水和透明程序依次为70%乙醇，80%乙醇，95%乙醇I，95%乙醇II，无水乙醇I，无水乙醇II各1h;无水乙醇∶二甲苯=1∶1，二甲苯I，二甲苯II各40min。
2.2.2 优化方法 在实验过程中发现，不同浸蜡时间和不同配方苏木精染液对实验结果影响较大，参考常规方法进行了改进。浸蜡总时间设置了90min、120min、150min、180min4个梯度，苏木精染色步先染液设置了埃利希（Ehrlich）苏木精与磷钨酸苏木精对比实验。
2.2.3 图像采集 取上述中性甲醛的斑马鱼器官，石蜡包埋后进行连续切片（厚度为4um），染色后中性树胶封固，在徕卡倒置显微镜下观察并采集图像。
3 结果与分析
3.1 浸蜡的影响 充分浸蜡，可以保证切片时组织的完整性，浸蜡是否充分主要与处理时间有关。浸蜡程序一般为石蜡（I）、石蜡（II）和石蜡（III）总共1～3h，实验研究中设计了4个梯度时间方案（表1）。结果显示，浸蜡总时间为90min时，斑马鱼心脏和肠组织内部均不能充分浸蜡，制片后心肌组织结构出现较多空洞（图1A），肠组织明显断裂（图1B）;浸蜡总时间延长为120min时，心脏结构比较完整清晰，但是心脏组织结构仍较多断裂（图1C），肠组织结构有少部分断裂（图1D）;当浸蜡时间延长至150min时，保证了充分浸蜡，斑马鱼心脏和肠组织结构最完整清晰（图1E和图1F）;当浸蜡时间延长至180min时，虽然保证了充分浸蜡，但是制片观察发现斑马鱼石蜡切片较厚，心脏和肠组织结构都不清晰（图1G和图1H）。
3.2 苏木精染色液的影响 苏木精-伊红染色法是制作石蜡切片时常用的染色方法，当染色时间同设为30min时，埃利希（Ehrlich）苏木精与磷钨酸苏木精的染色结果显示，埃利希苏木精染色后斑马鱼肝脏细胞轮廓不明显（图2A），使用磷钨酸苏木精染色后斑马鱼肝脏组织切片中明显可见肝细胞呈圆形，细胞核居中，多为1个（图2B），可见使用磷钨酸作为媒染剂时细胞着色更加清晰。
4 结论
斑马鱼体型较小，器官多柔软且小，充分浸蜡可以保证切片的完整性。浸蜡温度以石蜡刚刚溶化为好，当浸蜡时间为150min时，组织可以充分浸蜡，组织结构最完整;而时间较短时，组织易断裂。苏木精染色效果较为关键，以磷钨酸为媒染剂的苏木精配方染色，斑马鱼肝细胞形态更加清晰，细胞核也明显可见。
参考文献
[1]贾顺姬，孟安明.中国斑马鱼研究发展历程及现状[J].遗传，2012，34（9）：1082-1088.
[2]何嘉玲，刘静，王天奇，等.斑马鱼的质量标准化[J].中国实验动物学报，2014，22（6）：99-102.
[3]陈微，章琳俐，杨平，等.斑马鱼端脑的微细形态与结构[J].水产学报，2015，39（3）：371-380.
[4]陈微，章琳俐，刘仪，等.斑马鱼中脑微细结构及相关免疫组化反应[J].畜牧与兽医，2015，47（12）：89-93.
[5]林金杏，章琳俐，姚一琳，等.斑马鱼肠道显微和超微结构的研究[J].畜牧与兽医，2013，45（3）：60-66.
[6]郑伟，严继舟.斑马鱼组织石蜡切片质量的优化[J].江苏农业科学，2013，41（11）：260-263.
（责编：张宏民）
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