疟疾诊断技术进展与应用

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　　[摘要]疟疾是一种严重危害人类生命健康的蚊媒传染病，由于免疫学、分子生物学和生物化学技术的不断发展，陆续产生一些疟疾诊断的新技术，本文就疟疾各种诊断技术的原理和应用作简要综述。笔者认为，当前我国处于消除疟疾监测阶段，阻断病例境外输入，快速诊断外出回归人群中的疟原虫感染者，及时处置疟疾疫情是关键。在疟原虫镜检技术的基础上，实验室研究着重于DNA探针技术和PCR技术的应用，基层医疗单位和现场监测要推广应用胶体金免疫层析技术的快速诊断试剂，尤其是杭州艾康和广州万孚等国产产品，价格低廉，简便快速，灵敏度和特异度高，需要尽快普及。
　　[关键词]疟疾;诊断技术;富组氨酸蛋白一Ⅱ;疟原虫乳酸脱氢酶
　　[中图分类号] R531.3
　　[文献标识码]A
　　[文章编号]2095-0616（ 2019） 01-34-05
　　疟疾是疟原虫经按蚊传播感染人体而引起的一种虫媒传染病，严重危害着人类的生命健康，被列为全球关注的三大公共卫生问题之一。最近世界卫生组织发布的《2016年世界疟疾报告》显示，2016年全球疟疾控制出现停滞不前现象，有91个国家和地区有疟疾流行，估计新发病数达到2.16亿，较2015年增加约500万例，其中死亡44.5万人，与2015年基本持平[1]。因为研究疟疾防治产生了两位诺贝尔生理学及医学奖获得者，美国科学家罗斯因揭示“疟原虫通过按蚊叮咬途径感染人体”于1902年获奖，中国药学家屠呦呦因“创制抗疟药青蒿素和双氢青蒿素，有效降低疟疾死亡率”而于2015年获奖。人类对疟疾防治的研究从不停步，及时、准确的诊断对有效治疗疟疾及控制流行具有重要意义，由于免疫学、分子生物学及生物化学技术的不断发展，针对疟疾传统诊断方法的改进及新的诊断方法陆续產生[2-3]，现就疟疾诊断技术方面的进展和应用进行简要综述。
　　1 非免疫学诊断
　　1.1 临床诊断
　　以疟疾发病的临床特点作为诊断依据：间歇性发作的寒战、高热，伴不同程度的头痛、腰痛、关节痛和肌肉酸痛，口渴狂饮，恶心呕吐，继以大汗淋漓、疲乏无力、昏沉入睡而缓解。临床症状可以简单归纳为冷、热、痛、渴、汗和睡六个字。我国五十、六十年代初大规模普查普治阶段，因显微镜和镜检人员缺乏而广泛应用，至今国内外一些条件落后的偏远农村和跟随工程迁移而搭建的临时工棚区仍沿用。一些老疫区居民常常根据这些表现自我诊断、自行服药治疗，由于不正规的治疗加上自身免疫力因素，患者转成无症状带虫者成为疟疾的传染源，同时疟疾的症状无绝对的特异性，与许多发热性疾病混淆不清而误诊，恶性疟误诊造成延误治疗病死率高。从流行病学观点和医疗安全角度来看，在医学技术、医疗服务快速发展的今天，临床诊断只能作参考，不宜提倡。
　　1.2 镜检法
　　采集患者外周血，涂制厚血膜和薄血膜血片，然后进行溶血染色处理，最后在显微镜油镜头下查找血膜中是否存在疟原虫从而作出诊断，只要镜检者经验丰富，涂片和染色符合要求，镜检时仔细认真，血中只要存在疟原虫，漏检几无可能，具有百年历史的疟原虫镜检迄今仍有疟疾诊断“金标准”的美称。采集外周血4 - 5μL在载玻片中央偏右涂成直径0.8 - l.Ocm的圆形厚血膜，取1.0 - 1.5μL外周血于载玻片左1/2 - 1/3位置用推玻片推成宽约2cm的舌状薄血膜，用记号笔在载玻上写上受检者号码，自然干燥。尽量在48h内，用甲醇固定薄血膜（1- 3min），用蒸馏水对厚血膜进行溶血处理，晾干后用2%吉氏染液浸泡20 - 30min，然后用清水反复漂洗，取出晾干。镜检时在厚血膜滴香柏油一滴，用油镜从自上而下，从左到右，再由右向左，这样往返不遗漏地查遍整个血膜，薄血膜仅作为原虫分类时参考检查[4]。该方法具有检出率高，可以定虫种，可以确定原虫密度，价格低廉，血片可以长期保存等优点，是检验其他诊断方法特异度、灵敏度和稳定性的评价标准;但也存在费工费时，对客观依赖性太强的缺点。
　　1.3 血液棕黄层定量分析法
　　血液棕黄层定量分析（ quantitative buffy coat，简称QBC法），创建于1983年，首先由Wardlaw等人将其应用于定量分析血液有形成分，被美国Becton Dickinson公司用于检查红内期疟原虫并商品化。原理是依据感染疟原虫的红细胞比正常红细胞轻，比粒性白细胞略重的特性，定量采集末梢血置于装有抗凝剂（草酸钾、肝素）、荧光染料吖啶橙和一个与白细胞比重相同的柱形塑料浮子的特制的QBC管中，用封帽盖住毛细管底端，经10000转离心5min，将QBC管水平放在专用板上，在荧光显微镜高倍镜下镜检，感染疟原虫红细胞浓集于未感染红细胞和血液棕黄层之间，经荧光染料吖啶橙染色呈桔黄或黄绿色，从QBC管底端起依次为正常红细胞层、受染红细胞层（约1mm）、白细胞层（约5mm）、塑料浮子和血浆层，恶性疟原虫配子体显示为弥漫性绿光，间日疟裂殖体为分叶状光点，根据光点大小、形状及染色特点来判断疟原虫的存在[5]。临床应用结果表明，该法操作容易、快速，检测一份样品只需lOmin，且可同时操作多份样品。QBC法存在的主要问题是成本较高，需要荧光显微镜，所使用的QBC管价格昂贵（1.0美元/支），且不能重复使用，虽在实验室中检测效果较好，但在现场应用尚不尽如意，因此目前只是作为疟疾诊断的一种辅助方法。
　　1.4 DNA探针技术
　　人体感染疟原虫血液中一定有疟原虫核酸（ DNA）的存在。DNA探针技术检测疟原虫就是使用一定的示踪物对特定基因序列的核酸片段（探针）进行标记，然后通过探针与待测样本中互补片段的特异性结合，检测判断血样中疟原虫DNA的存在[6]。Franzen等[7]1984年首次报告应用DNA探针用基因杂交方法诊断恶性疟疾。之后该方法不断改进，其检测灵敏度、特异度和稳定性大幅度提高。DNA探针直接检测寄生虫基因，不仅可以发现原虫感染，且可以用来鉴别虫种，不足的是，操作繁琐，成本较高，还需要使用放射标记，限制了其现场应用。 　　1.5 聚合酶链式反应技术
　　聚合酶链式反应（ PCR）技术由美国Cetus公司1985年创建，是体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术。通过反复拷贝扩增疟原虫的特异性基因片段，增强分析信号，使引物限定的目标DNA片段扩增数百万倍，样品中含量极低的目标DNA片段得以检出，具有很高的特异度及灵敏度。为减少样品污染，降低操作过程中疟原虫DNA的丧失和降解，提高疟疾检测的灵敏度，简化操作过程，PCR诊断技术不断改进，产生了套式PCR（ NestedPCR） [8-9];之后又不断出现RCR-杂交法，PCR-RFLP.RAPD等以PCR为基础的疟疾检测方法[10]，应用于疟疾现场检测、流行病学调查、实验室研究等。该检测技术特异度和灵敏度高，应用前景广阔，但受限于对实验条件和技术水平要求较高，投入成本较大。
　　2 免疫学类诊断
　　利用分子免疫学原理生产的，应用于数百种疾病初筛或诊断的试剂盒，以其灵敏度和特异度高，无需大型设备而受医学界的广泛欢迎。按其标记方法分为酶标法、荧光标记法、同位素标记法、金属溶胶标记法、磁颗粒标记法、染料标记法、有色乳胶标记法等，点印渍法和层析试条法还设计出一种试剂可同时测多种分析物的方法。该技术對各分析物可进行定性、半定量甚至定量测定，其发展之快，成果之多，令人目不暇接，由此产生了庞大的产业，成为疾病诊断学界的主流产品。
　　2.1 凝聚法
　　就疟疾诊断而言，凝聚法中又分为直接血凝法（ DAT）和间接血凝法（IAT）两类。DAT系把具有疟原虫抗原的溶胞液包被在聚苯乙烯乳胶珠上，再按10：1的体积加入被检人血清，再在各种NaCI浓度（0 - 300mM）下计算凝集时间，并按特定公式计算出感染程度，由于误差较大，准确率较低，应用价值有限。IAT则把抗原结合于乙醛固定的0型红细胞，加入被检人血清，其中若存在针对此抗原的抗体，就会发生凝聚而被检出，此法操作简易，但灵敏度和特异度较差，只能作为辅助诊断工具。
　　2.2 酶联免疫吸附法（ EIISA）
　　此法系利用包被单抗（或多抗）/全血中所含抗原/标记单抗（或多抗）这三者能特异性结合，形成三元复合物而被检出的方法。该方法灵敏度可与镜检法相当，特异度高、可同时检测多个样品;存在的问题是必须由专业人员操作，而操作又极繁琐，需逐一有序地加入全血、标记单抗、底物、终止液等试剂，中间还有多次清洗操作，耗时较久，一次试验要2h以上。
　　2.3 免疫点印渍法
　　免疫点印渍法的原理和ELISA法相同，只是作了一些改良，即用硝酸纤维素等滤膜替代96孔塑料板，这种改动不仅灵敏度和特异度与ELISA法相当，减少了操作步骤，防止了ELISA法中因甩打式洗板方式造成的环境污染，而且全程仅需lOmin，深受用户欢迎。但由于该法应用与免疫层析技术相比逊色不少，故虽有论文报道，但无实际产品上市。
　　2.4 免疫层析法检测
　　胶体金免疫层析技术的原理是在硝酸纤维素膜上包被疟原虫特异性单克隆抗体作为捕获带，然后用胶体金标记同一抗体，层析过程中标记抗体与捕获到疟原虫抗原通过捕获带时发生颜色反应，即可判断存在疟原虫感染。疟原虫乳酸脱氢酶（ PIDH）和恶性疟原虫特有的富组氨酸蛋白一Ⅱ（HRP-Ⅱ）是目前常用的检测靶抗原，传统疟疾胶体金诊断试盒主要以HRP-Ⅱ为检测靶点，只能检出恶性疟;目前应用最广泛的是以PLDH为检测靶点的疟疾胶体金诊断试剂盒，既能检测恶性疟和间日疟又能检测出卵形疟。目前国际上应用较多的有Para sight-F试剂盒、ICT Malaria P.f&P.f/P.v诊断试剂盒、Opti MALR试剂盒、Binax NOW⑩试剂盒、Care Start疟疾HRP-Ⅱ/PLDH复合试剂盒;国内应用较多的有杭州艾康P.f/P.v试剂盒和广州万孚疟原虫检测试剂盒等。
　　2.4.1 Para sight-F试剂盒 美国BectonDickinason公司生产，为世界卫生组织推荐使用的恶性疟原虫快速诊断试剂之一。利用特异的单克隆抗体来检测恶性疟原虫HRP-Ⅱ，从而判断检测血样中恶性疟原虫的存在。其说明书声明原虫密度大于60个/μL血时，与镜检法比较检出恶性疟的灵敏度和特异度分别为96.5%- 100.0%和81.1% - 98.7%，原虫密度下降灵敏度下降，与杨亚明等[11]使用Para sight-F试剂盒在云南西南部检测187例疑似恶性疟患者结果一致。
　　2.4.2 ICT Malaria P.f/P.v诊断试剂盒 为澳大利亚Austcard公司产品，以HRP-Ⅱ为检测靶物，原理为在硝酸纤维素膜分别包被特异性的恶性疟HRP-Ⅱ单克隆抗体和pan-malaria antigen（ PMA）单克隆抗体，可同时检测恶性疟和间日疟。张再兴等[12]在云南用该试剂检测结果显示恶性疟和间日疟灵敏度为85.71%和69.57%，恶性疟和间日疟的特异度分别为99.12%和99.12%，与国内外相关报道结果接近。
　　2.4.3 0pti MALR诊断试剂盒 由美国俄勒冈Flow Inc公司生产，以PLDH为检测靶抗原。王真瑜等[13]检测云南流行区疟疾患者血样200份及上海健康者血样60份进行比较分析，Opti MAL检测总体灵敏度和特异度为95.5%和100.0%，恶性疟、间日疟的灵敏度和特异度分别为90.0%、96.0%和99.4%、97.5%，均高于CICA试剂，与国内周升等[14]用Opti MAL检测结果相近。Iqbal A等[l5]1997年在科威特用Opti MALR诊断试剂盒检测550例发热患者，结果显示当虫体密度达100个/μL以上时，灵敏度与PCR、镜检方法检测性能相近为97%;原虫密度降低时，灵敏度下降到59%。国内外研究灵敏度存在差异，是否与地域虫种及感染密度有关有待进一步研究。 　　2.4.4 Binax NOWR诊断试剂盒 系美国InvemessMedical Innovation公司研制，诊断靶抗原为HRP-Ⅱ和醛缩酶（AID），ALD是所有疟原虫含有的特异性蛋白，该试剂可区分恶性疟和其他3种疟原虫。杨永昌等[16]应用该试剂盒对利比亚维和二级医院疑似患者131例进行检测并与镜检法比较，镜检法检出阳性34例，其中恶性疟33例，间日疟l例，Binax NOWR试剂盒检出恶性疟32例，间日疟1例，阴性符合率100%，阳性符合率97.06%，总符合率99.2%。与刘慧等I”]使用Binax NOWR试剂盒在中缅边境地区检测结果一致。
　　2.4.5 Care Start疟疾HRP-Ⅱ/PLDH复合试剂盒 由美国Access Bio公司研制，同时在硝酸纤维素膜上包被两种单克隆抗体于测试条两侧，分别特异性捕获疟原虫乳酸脱氢酶（ PIDH）和恶性疟原虫的富组氨酸蛋白一Ⅱ（HRP-Ⅱ），该诊断试剂盒专用于恶性疟和其他型疟疾的鉴别诊断。张勇等[18]使用该试剂盒与镜检法对103例疟疾、疑似疟疾进行检测对比分析，两方法检出阳性率没有统计学差异，该试剂的灵敏度和特异度分别为95.65%和97.50%。与孙晓东等[19]使用Care Start疟疾HRP-Ⅱ/PLDH复合试剂盒在中缅边境地区对疑似疟疾患者进行检测结果基本一致。
　　2.4.6 艾康P.f/P.v试剂盒 由我国杭州艾康生物技术有限公司研制，是最早投入使用的国内产品，通过在硝酸纤维素膜上包被两种特异性单克隆抗体来检测靶抗原HRP-Ⅱ和PLDH，判定疟原虫感染种类。孙晓东等[20]与王光泽等[21]应用艾康疟疾诊断试剂盒分别在云南和海南检测结果非常接近，总体灵敏度分别为92.56%和99.4%，特异度分别为98.57%和98.9%;恶性疟检测灵敏度分别为100%和100%，特异度分别为98.57%和99.3%;间日疟检测灵敏度分别为86.96%和98.8%，特异度分别为100%和100%。表明艾康疟疾诊断试剂盒能鉴别诊断恶性疟和间日虐，灵敏度和特异度比国外同类产品还好，并且价格低廉，非常适合镜检技术和条件不足的国内基层医疗单位、预防机构开展疟疾检测。
　　2.4.7 万孚疟疾诊断试剂盒 由我国广州万孚生物技术有限公司生产，在硝酸纤维素膜上检测区预先包被固定pfLDH和panLDH单克隆抗体，在质控区固定抗鼠IgC多克隆抗体，结合垫固定有panLDH单克隆抗体胶体金标记物。通过捕获全血样品中特异性恶性疟原虫乳酸脱氢酶（pfLDH）和疟原虫乳酸脱氢酶（ panLDH），结合检测过程中硝酸纤维素膜上质控区是否出现胶体金标记物panLDH抗体与抗鼠IgG多克隆抗体反应线来判定样本量是否足够，层析过程是否正常，综合判定是否存在恶性疟感染、惡性疟与其他疟原虫混合感染，恶性疟以外的其他疟原虫感染。魏容等[22]对86例2012年5月- 2016年5月间接诊的疑似疟疾患者利用万孚疟原虫检测试剂盒检测并与镜检法对比，其检测灵敏度为100%，特异度为97.43%，与镜检法相比无显著性差异，与薛成军等[23]2009年10月- 2010年7月在苏丹维和期间检测236份发热患者的结果一致。该方法具有操作简便，检测速度快，技术要求低且价格低廉等优势，适用于基层医院和大规模普查。
　　3 小结
　　综上所述，临床诊断从流行病学和医疗安全角度出发不宜提倡，仅供参考。镜检法作为疟疾诊断的金标准沿用至今，有着其他诊断方法不可替代的优势，特异度高，可直接鉴别虫种及原虫不同发育时期，可以确定原虫感染密度，对患者治疗有指导作用，而且成本低廉。QBC法虽然操作简易快捷，但需要价格昂贵的荧光显微镜和QBC管，很难推广。以分子生物学为基础的DNA探针技术和PCR技术，检测灵敏度和特异度高，且能鉴别虫种，但操作繁琐，对实验室条件和技术水平要求较高，仪器昂贵，成本高，主要适用于实验室研究。基于分子免疫学原理的疟疾诊断试剂盒，因其快速简便，无需大型设备而广受欢迎。其中凝聚法由于灵敏度和特异度不高而应用受限，ELISA法因操作繁琐而难于推广，免疫点印渍法则因综合性能竞争不过免疫层析法而没有产品上市。胶体金免疫层析技术生产的疟疾诊断试剂盒，因其灵敏度和特异度高，性能稳定，操作简便快速，对实验条件和技术水平要求不高，适合在基层医疗机构和现场工作中广泛应用。相对于国产的杭州艾康、广州万孚疟疾诊断试剂盒，Para sight-F试剂盒、ICT Malaria P.f/P.v试剂盒、OptiMAL试剂盒、BinaxNOW试剂盒、CareStart疟疾HRP-Ⅱ/pLDH复合试剂盒等国外产品，其共同缺点是价格比较贵。我国已进入消除疟疾监测阶段，2017年还实现了无本地感染目标，阻断境外输入疟疾病例是当务之急，应大力推广普及国产试剂盒在基层医疗机构的应用，针对日益增多的到非洲和东南亚务工、经商、旅游回归人员进行快速疟原虫检测，及时准确地诊断出疟疾患者并开展流行病学调查和处置。其他国家和地区可根据当地的疫情形势、经济状况和社会条件，选择一种或几种准确有效的疟疾诊断方法应用于疟疾防治的现场和研究工作。
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