峨眉拟单性木兰的开花生物学特性与繁育系统

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　　摘 要：為阐明峨眉拟单性木兰（Parakmeria omeiensis）在自然条件结实率低的原因和确定最佳人工授粉时期，该文通过观察峨眉拟单性木兰的开花动态，采用杂交指数估算、花粉胚珠比、花粉活力及柱头活性检测、人工授粉试验等方法对其繁育系统进行了研究。结果表明：（1）植物园保育的峨眉拟单性木兰花期在4月底到5月中下旬，持续17～23 d，雄株始花期比雌株早3～4 d，但两者花期可遇。（2）两性花经检测雄蕊败育，实为功能上的雌性，部分雄株个体的雄花上残留1～2个心皮，其性别分化是通过雌、雄蕊选择性败育形成的，为隐性雌雄异株（cryptic dioecy）。（3）雄花、两性花开放经历佛焰苞开裂、花被片开裂、展开、闭合、二次开放、凋落6个阶段，历时4 d。（4）雄花初次展开时花粉活力最高，达92.8%，开花2 d后活力显著下降;两性花柱头在花被片展开期可授性最强，盛开后柱头部分可授。（5）杂交指数为5，P/O比为2.14×104。（6）套袋试验表明，峨眉拟单性木兰不能进行自花传粉，人工异花授粉的结实率和出种数显著高于自然授粉，且不存在无融合生殖。这说明峨眉拟单性木兰繁育系统为专性异交，传粉过程需要传粉媒介，自然条件下结实率低，主要是受传粉昆虫和柱头可授期短的限制。
　　关键词： 峨眉拟单性木兰， 极小种群， 开花生物学， 繁育系统， 木兰科
　　中图分类号：Q944
　　文献标识码：A
　　文章编号：1000-3142（2019）05-0600-08
　　Flowering biological characteristics and breedingsystem of Parakmeria omeiensis
　　YU Daoping1，2， LI Cehong2， WEN Xiangying3， LI Xiaojie2， PENG Qixin1，2*， XIE Kongping1，2
　　（ 1. Sichuan Provincial Institute of Natural Resource Science， Chengdu 610015， China; 2. Emeishan Botanical Garden，Emeishan 614201， Sichuan， China; 3. South China Botanical Garden， CAS， Guangzhou 510650， China ）
　　Abstract：In order to explain the reasons for the low seed-setting rate ofParakmeria omeiensis in natural condition and determine the optimum pollinating time. The floral character were studied through field observation in Mount Emei， the type of breeding system was estimated by out-crossing index （OCI）， the pollen-ovule ratio （P/O）， pollen viability and the stigma receptivity， and the artifical pollination experiments were carried out. The results were as follows：（1） The florescence of P. omeiensis was from late April to mid-late May. Male plants bloomed 3-4 d earlier than female plants， and their florescence were overlapped. （2） Bisexual flowers were actually female in reproductive function， 1-2 carpels remained on the male flower of some male plants. The selective abortion of either pistil or stamens led to sex differentiation. So P. omeiensisbelongs to cryptic dioecy. （3） The flowering process followed six stages from spathe dehiscence， tepal dehiscence， spreading， closing， the second spreading to flowers withering， which took 4 d. （4） The viability of pollen in male flowers reached the highest （92.8%） during the first spreading， and then descended greatly after 2 d. The stigmas of bisexual flowers were strong receptivity when all tepals were spreading， while some stigmas were receptive after bloo-ming. （5） The out-crossing index （OCI） was five and pollen/ovule was 2.14×104， which indicates that P. omeiensisshould be classified as an allogamous plant. （6） The artificial pollination revealed the self-pollination phenomenon did not exist and had no apomixis phenomenon. The fruit-setting rate and seed-setting rate were significantly higher than that of natural pollination. In conclusion， the breeding system of P. omeiensis was obligate cross-pollination which requires pollinators， and its fruit-setting rate was limited by pollinators and the short stigma receptivity under natural conditions. 　　Key words： Parakmeria omeiensis， extremely small populations， flowering biology， breeding system， Magnoliaceae
　　峨眉拟单性木兰（Parakmeria omeiensis）是木兰科（Magnoliaceae）拟单性木兰属的常绿乔木，树干通直，叶片光亮、深绿，花香怡人，种皮橘红色，是一种优良的观赏植物。该种是拟单性木兰属的模式种（胡先骕和郑万钧， 1951;刘玉壶等， 1995）， 也是研究被子植物起源、系统发育的珍贵材料。峨眉拟单性木兰仅产于四川峨眉山，分布于海拔1 200～1 300 m的常绿阔叶林中，在峨眉山野外仅发现两个居群，个体数量不到100株，野外自我更新非常困难。1999年被列为国家一级重点保护野生植物，2007年世界自然保护联盟（IUCN）全球红色名录将其列为极度濒危（CR）物种，也是我国急需拯救保护的120种极小种群野生植物之一。由于其分布的局限性，目前有关峨眉拟单性木兰的研究报道仅限于群落特征（庄平等，1993）、组织培养（陈英和马明东，2008）、繁育及迁地保育（余道平等，2010;余道平和李策宏，2017），而未见其开花生物学方面的研究。
　　峨眉拟单性木兰在自然状态下虽开花量较大，但其结实率低，且果实不够饱满，林下幼苗极少。这可能与其繁育系统密切相关，因此，本研究以保育在峨眉山植物园的峨眉拟单性木兰居群为研究对象，探索其开花物候及其繁育特征，从生殖生物学角度找到其可能存在的濒危原因，为有效保护该物种提供理论依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 研究地自然环境概况
　　峨眉山植物园（103°22′ E， 29°35′ N， 海拔800 m），该园区属于亚热带湿润季风气候，年均气温为17.3 ℃，绝对最高温度为34 ℃，绝对最低温度为-3 ℃，年均降水量为1 555.3 mm，年均相对湿度为85%，年日照时数为1 398 h，无霜期为300 d （方志强等， 2017）。
　　1.2 开花进程及花部综合特征的观察
　　2015—2017年连续3 a随机选择未开放的雄花和两性花各10朵，对其进行标记，并观察记录花朵形状，花粉散出时间、单花开放持续时间、花凋谢的先后顺序。随机摘取当天开放的雄花、两性花各15朵，统计花瓣数和雄蕊数量，并采用游标卡尺测量花的直径和雄蕊长度。随机取开花各时期的花朵，固定于FAA（50%乙醇∶甲醛∶乙酸=90∶5∶5）溶液中。
　　1.3 花粉生活力与柱头可授性的检测
　　采用过氧化物酶法对不同开花时期的花粉进行活力测定。随机选取不同时期的雄花、两性花3朵，将每朵花的花粉取出混匀后置于凹面载玻片上，加入试剂Ⅰ（0.15%联苯胺∶0.5% α-萘酚∶0.25%碳酸钠=1∶1∶1）和试剂Ⅱ（0.3%过氧化氢）各1滴，搅匀后盖上玻片，30 ℃下经10 min后在Olympus BH-2型光学显微镜低倍镜下观察，统计6个视野全部花粉量及红色花粉，重复3次。花粉活力=红色花粉量/全部花粉量×100%。
　　柱头可授性用联苯胺-过氧化氢法（Dafni， 1992）测定。随机选取不同开花时期的柱头各5枚，浸入含有联苯胺-过氧化氢反应液（1%联苯胺∶3%过氧化氢∶水= 4∶11∶22）的烧杯中，置于Olympus BH-2型光學显微镜低倍镜下观察其柱头的可授性。柱头周围呈蓝色并有大量气泡出现，表明柱头具有可授性。
　　1.4 花粉胚珠比（P/O）与杂交指数（OCI）的估算
　　随机选择5株雄株、两性花株， 各采2朵即将开放的花蕾，FAA溶液固定，用悬浮液法（王玉兵等，2011）测定花粉量。统计每朵花的胚珠数，再乘以心皮数，即得总胚珠数，用单花花粉量除以单花总胚珠数计算花粉胚珠比（P/O）。
　　按照Dafni（1992）的标准进行花朵大小及开花行为的测量及繁育系统的评判。（1）花朵直径<1.0 mm记为0;1.0 ～ 2.0 mm记为1;2.1～ 6.0 mm记为2;> 6.0 mm记为3。（2）花药开裂时间与柱头可授期之间的时间间隔：同时或雌蕊先熟记为0;雄蕊先熟记为1。（3）柱头与花药的空间位置：同一高度记为0;空间分离记为1。三者之和为杂交指数（out crossing index， OCI）。繁育系统评判标准如下：OCI=0时为闭花受精;OCI=1时为专性自交;OCI=2时为兼性自交;OCI=3为自交亲和，有时需要传粉者;OCI≥4时为部分自交亲和，异交需要传粉者。
　　1.5 人工控制授粉试验
　　随机选取不同方向的花蕾，进行不同控制试验。因峨眉拟单性木兰两性花中雄性不育，可排除自花授粉的情况，所以只做4种处理。（1）自然对照：不作任何处理，标记挂牌至结实。（2）套袋处理：开花前用硫酸纸袋套住单花，挂牌标记至花凋落。（3）套网处理：花蕾期用尼龙网套住单花，挂牌标记至花凋落。（4）人工授粉：花蕾开放期，采集刚散粉的雄株花粉进行人工授粉，挂牌标记至花凋落。统计坐果情况，坐果率=坐果数/花数×100%。
　　1.6 数据处理
　　利用 Excel 2007软件进行统计及图表绘制，用SPSS19.0软件对花粉活力、坐果率、每果实出种粒数进行单因素方差（One-way ANOVA）分析，统计数据用平均值±标准差表示。
　　2 结果与分析
　　2.1 开花动态
　　2.1.1 花的形态特征及性别 峨眉拟单性木兰为单花顶生，具有佛焰苞1枚，花被片9～12枚，分内中外三层，乳白色并带有清纯的香味，雄花花冠直径为（5.6 ±0.38）cm，雄蕊（39.6±5.07）枚，花药长（2.5 ± 0.20）cm，花药内向开裂，花丝鲜红色（图版Ⅰ：A）;两性花花冠直径（图版Ⅰ：D）为（5.2±0.29）cm，雄蕊（25.2±2.88）枚，花药长（1.8±0.19）cm，花丝红棕色，花药隔紫色，绿色的雌蕊群呈椭圆状卵圆形，具短柄。 　　峨眉拟单性木兰花性别分化比较特殊，为雄花两性花异株，两性花虽然在形态上都具有雌蕊和雄蕊，但经检测其雄性不育，实为功能上的雌花，为隐性雌雄异株（cryptic dioecy）。目前保育在植物园里的峨眉拟单性木兰植株已有25株进入开花期，其中雌株 10株，雄株 15株。有部分雄株个体的雄花上有未完全败育的雌蕊柱，残留1～2个心皮（图版Ⅰ：B，C），雄花的雄蕊花药饱满，花粉量多，成熟时能正常开裂散粉（图版Ⅰ：A）。两性花中的雄蕊发育不正常，较雄花的短小、扁化，数量少，花粉囊不开裂，位于雌蕊群下方;雌蕊发育正常，子房膨大，成熟时柱头能分泌大量粘液（图版Ⅰ：D）。
　　2.1.2 开花物候 连续3 a对植物园居群的开花植株进行观察，结果见表1。峨眉拟单性木兰2月底3月初花芽开始萌动，4月底5月初为始花期（5%的花开放），5月上旬为盛花期（50%的花开放），5月中下旬为末花期（超过75%的花开放），开花持续时间平均达20 d，但每年的始花期、盛花期及末花期受天气影响较大。2015年峨眉山地区3—4月份主要是阴雨天气，气温不高，开花期推迟到5月初;2016、2017年峨眉山地区3—4月份天气以晴朗为主，气温较高， 開花初期在4月底， 盛花期及末花期提前5～7 d。由表1可知，整个居群的开花初期在逐渐提前，且雄株比雌株提前开花，雌株较雄株花期短，单株开花为树冠上层先开，然后到中层，再到下层，阳面先开。野生居群的峨眉拟单性木兰由于海拔较高（1 200～1 300 m），花期较峨眉山植物园居群推迟10～15 d。
　　2.1.3 单花开花进程 从单花开放进程来看，佛焰苞开裂到所有花被片脱落可持续4 d。雄花和两性花都经历了佛焰苞开裂、花被片开裂、展开、闭合、二次开放、凋落6个阶段。其中雄花的佛焰苞从9：00时开裂（图版Ⅱ：A） 到其脱落需要5 h，14：00时外轮花被片开裂（图版Ⅱ：B），4 h后（下午6点半时）所有的花被片展开，此时雄蕊花药开裂，开始散粉。1.5 h后达到盛开（图版Ⅱ：C），此时绿色的外轮花被片逐渐向下反卷，盛开状态维持1 h后，中轮和内轮花被片开始慢慢闭合，到21：00时，完全处于闭合（图版Ⅱ：D），外轮花被片继续向花托方向卷曲。第2 天上午白色的两轮花被片仍处于闭合状态，闭合时间达17～18 h，直到下午2—3点花被片慢慢再次打开，花粉已散完，第3 天花被片继续打开，外轮花被片和花药开始变褐，第4天花药和花被片慢慢凋谢、脱落（图版Ⅱ：E）。
　　两性花与雄花开花动态基本一致，两性花中的雄蕊低于雌蕊柱且不散粉，在花被片初次展开期，柱头会有大量粘状分泌物，花完全打开维持的时间较雄花稍长（1.5～2 h），随后慢慢闭合，第4天柱头顶端开始变褐，花药和花被片开始凋谢（图版Ⅲ）。
　　2.2 花粉活力和柱头可授性
　　不同时期的雄花花粉活力检测结果表明，散粉当天花粉活力最强，平均达（92.8±1.67）%，开花第2天略低，为（80.6±1.33）%，开花第3天，花粉活力仅为（35.7±0.67）%。两性花中的雄蕊花药不开裂，花粉极少，且无活力。不同开花进程柱头可授性检测结果见表2，在花被片初次展开期间，柱头可授性最强，此时柱头有大量粘性分泌物，向下反展成鸡冠状，盛开时部分柱头可授性，闭合与二次展开期间柱头均不具有可授性。
　　2.3 花粉胚珠比（P/O）和杂交指数（OCI）的估算
　　峨眉拟单性木兰的雄花单花花粉量为4.27 ×105粒，两性花单花雌蕊具有 9～12心皮，平均胚珠数20个，P/O比为2.14 ×104。依据Cruden（1977）的标准，当P/O值为2.7～5.4时为闭花受精;P/O值为18.1～39.0时为专性自交;P/O值为31.9～396.0时为兼性自交;P/O值为244.7～2 588.0时为兼性异交;P/O值为2 108.0～1 955 25.0时为专性异交。峨眉拟单性木兰繁育系统为专性异交类型，这与其花的类型及花性别特征相一致。
　　根据Dafni（1992）的标准，峨眉拟单性木兰的单花直径>6.0 mm记为3，柱头与花药的空间分离记为1，雌雄蕊成熟不一致，记为1。因此，峨眉拟单性木兰的杂交指数OCI=5，其繁育系统为异交，需要传粉者。
　　2.4 人工控制授粉试验结果
　　对峨眉拟单性木兰不同授粉处理的坐果情况进行比较发现，人工授粉、套袋和套网处理的坐果率与自然授粉坐果率差异显著异，人工授粉的坐果率（93.3±4.4）%、出种数（14.9±1.2）粒显著高于自然授粉。套网处理的坐果率显著低于自然对照，高于套袋处理，说明传粉媒介对结实有显著的影响。套袋无结实现象，说明峨眉拟单性木兰不存在无融合生殖现象。
　　3 讨论与结论
　　3.1 峨眉拟单性木兰开花特性、花性别与生殖适合度
　　由于近交衰退，植物演化成了诸如雌雄异熟、雌雄异位、异长花柱、自交不亲和等多种促进异交的形态和生理机制（Barre et al.，2000）。木兰科植物花的特点具有雌雄异熟、雌雄异位的特点（潘丽琴等，2018;Wang et al.，2010;孟希等，2011）。峨眉拟单性木兰的两性花在形态上虽具有雌蕊和雄蕊，但经检测其雄性不育，实为功能上的雌性，为隐性雌雄异株（cryptic dioecy），这样的性系统在植物界极少见。这与同属的云南拟单性木兰（徐加汉等，2002）和乐东拟单性木兰（徐凤霞，2002）表现的性别分化类型相同，这是植物促进异交、适应生境、争取生殖成功的一种途径。迁地保育的峨眉拟单性木兰居群初花期集中在4月底5月初，而年度间出现的差异可能是由于气候条件的差异所引起的。虽然雄株较雌株先开放3～5 d，但单株开花可持续20 d左右，与雌株花期有重叠现象，因此，不存在花期不遇的问题。
　　3.2 峨眉拟单性木兰二次开合的生物学意义 　　对大部分植物来说，开花通常是一次性绽放，之后花瓣凋谢而终止开花进程，而峨眉拟单性木兰开花进程是开放和闭合交替进行的，称之为“二次开合”。峨眉拟单性木兰的雄花和两性花盛开后维持1～2 h后慢慢进入闭合，闭合状态要维持17～18 h。据报道，多数木兰科植物的开花存在二次开合现象，如木兰属的白玉兰（Magnolia denudata）（Wang et al.， 2010）、广玉兰（M. grandiflora）（孟希等，2011）、天女木兰（M. sieboldii）（于思桦等，2017）、木莲属的大果木莲（Manglietia hookeri）（付玉嫔等，2010）、厚叶木莲（M. pachyphylla）（杨晓丽，2013）、 灰木莲（M. glauca）（潘丽琴等，2018）。但是，不同植物其二次开合所表现的雌雄性征有所不同，峨眉拟单性木兰雄花在第一次展开时雄蕊已成熟，花药开裂，花粉散出，到第二次打开时，花粉已基本散完。这一结果与雌雄同体的广玉兰、白玉兰二次开合的性状表现有所不同，由于它们存在雌雄异熟现象，其雌蕊成熟时促使其初次展花，雄蕊成熟时促使其第2次展花。而峨眉拟单性木兰在雄花第一次展花时，雄蕊就已成熟了。有报道认为植物开放后再闭合这一生物学特性有利于保護柱头（付玉嫔等，2010;潘丽琴等，2018），使花内形成小温室促进散落在柱头的花粉萌发，为传粉昆虫提供庇护场所增加昆虫的传粉效率（Wang et al.，2010），也能避免其他物种花粉的二次干扰，以保证自身物种的纯度，这是植物的一种生殖策略。
　　3.3 峨眉拟单性木兰繁育系统特征
　　峨眉拟单性木兰雄花散粉时花粉活力很强，开花当天为92.8%，花粉量较大，为4.27×105粒，完全足够让每一个胚珠受精。因此，花粉活力、花粉量不影响峨眉拟单性木兰的生殖过程。这与目前有关木兰科植物花粉特性的报道一致（杨旭等，2012;刘坤良等，2013;柴弋霞等，2017）。柱头可授期是花朵成熟过程中的一个重要时期，因物种的差异而有所不同，一般持续时间从几小时到十几天不等。有些植物当其柱头具有可授性时常伴随着明显的形态变化，如出现分泌物、颜色发生变化、柱头分裂等。经观察，峨眉拟单性木兰在具有可授性时，柱头有大量白色粘性的液体分泌物，柱头向下反卷，绿色，花被片第一次展开到闭合这期间柱头具有最强的可授性，维持的时间较短，这与同属的云南拟单性木兰（徐加汉等，2002）和乐东拟单性木兰（陈红锋，2006）的柱头形态变化一致。峨眉拟单性木兰P/O值为2.14×104，杂交指数为5，按Cruden（1977）和Dafni（1992）的标准，峨眉拟单性木兰的繁育系统为专性异交。在我们的观察中只发现了6种访花昆虫，且在花被片第一次展开期间访花昆虫很少，待花被片闭合后才会有较多的昆虫来访花，而此时柱头可授性大大降低，无法保证传粉的成功。这与孙燕（2015）和赖家业等（2007）有关光叶木兰 （Magnolia dawsoniana）和单性木兰（Kmeria septentrionlis）的研究结果一致。因此，有效传粉昆虫的缺乏和较短的柱头可授期是峨眉拟单性木兰结实率低的主要原因。胚珠数决定每个果实的最大种子数量，从而影响种子产量。在本研究中，峨眉拟单性木兰的平均胚珠数为20，若所有胚珠受精且发育，则平均每个果实发育成20粒种子，然而在自然条件下每果实出种量平均不到7粒，而人工授粉显著提高了其结实率和出种量，平均每果实出种数接近15粒，说明传粉是影响峨眉拟单性木兰生殖成功的关键环节。
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