基于多指标成分定量评价复方鱼腥草胶囊

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　　摘要 目的：基于多指標成分定量评价分析复方鱼腥草胶囊，为复方鱼腥草胶囊的质量控制提供参考。方法：首先制备复方鱼腥草胶囊供试品溶液及槲皮苷、表告依春、绿原酸、连翘苷、黄芩苷对照品溶液，色谱条件采用CAPCELL-PAK-MG-C18色谱柱（5 μm，规格：4.6 mm×250 mm），柱温以35 ℃为宜，进样量为10 μL，流速为1.0 mL/min进行高效液相色谱（HPLC）检测，以流动相A（乙腈）和流动相B（水+0.01%磷酸）为条件进行梯度洗脱，优化高效液相（HPLC）的方法学严谨性，进行线性回归、精密度、重复性、稳定性、专属性试验和加样回收率试验，多指标成分定量分析样品中槲皮苷、表告依春、绿原酸、连翘苷和黄芩苷的含量。结果：1）采用HPLC色谱法对复方鱼腥草胶囊中鱼腥草、板蓝根、金银花、连翘、黄芩等进行专属性试验，结果显示复方鱼腥草胶囊中鱼腥草、板蓝根、金银花、连翘、黄芩专属性良好。2）线性范围考察结果显示槲皮苷对照品、连翘苷对照品、绿原酸对照品在4～201 μg/mL范围内、表告依春对照品、黄芩苷对照品在12～601 μg/mL范围内的线性关系均良好。3）精密度试验结果显示槲皮苷、连翘苷、绿原酸、表告依春对照品、黄芩苷峰面积相对标准偏差（RSD）分别是0.45%、0.52%、0.66%、0.59%、0.31%，结果表明此色谱条件下的HPLC仪器精密度良好。4）稳定性试验结果显示复方鱼腥草胶囊供试品溶液相对峰面积RSD是1.33%，表明24 h内复方鱼腥草胶囊供试品溶液基本稳定。5）重复性试验结果显示复方鱼腥草胶囊供试品溶液相对峰面积RSD为0.92%，表明该HPLC方法的重复性良好。6）结果显示槲皮苷、表告依春、绿原酸、连翘苷和黄芩苷的平均回收率分别为99.10%、99.26%、99.07%、98.05%、98.82%、98.32%，RSD为1.81%、1.49%、0.94%、1.58%、1.01%，表明回收率较好。7）基于多指标成分定量测定结果显示不同厂家不同批次的复方鱼腥草胶囊中有效成分槲皮苷、表告依春、绿原酸、连翘苷和黄芩苷的含量存在较大差异。结论：基于多指标成分定量测定结果显示不同厂家不同批次的复方鱼腥草胶囊中有效成分槲皮苷、表告依春、绿原酸、连翘苷和黄芩苷的含量存在较大差异。
　　关键词 多指标成分定量;高效液相;复方鱼腥草胶囊;槲皮苷;表告依春;绿原酸;连翘苷;黄芩苷
　　Abstract Objective：Based on the quantitative evaluation and analysis of compound Houttuynia cordata capsule based on multi-index components，it provides a reference for the quality control of compound Houttuynia cordata capsule.Methods：First，the compound Houttuynia capsule sample solution and quercetin were prepared，including Yichun，chlorogenic acid，forsythrin，baicalin reference solution，The chromatographic conditions were determined by high performance liquid chromatography（HPLC） with CAPCELL-PAK-MG-C18 column （5 μm， specification： 4.6 mm × 250 mm），column temperature 35 ℃，injection volume 10 μL，flow rate 1.0 mL/min）. Gradient eluting was carried out under the conditions of mobile phase A （acetonitrile） and mobile phase B （water 0.01% phosphate）.Optimize the methodological rigour of high performance liquid phase （HPLC），carry out linear regression， precision， reproducibility，stability，specificity test and sample recovery test，quantitative analysis of quercetin in samples with multiple index components，Quercetin， chlorogenic acid，The contents of phillyrin and baicalin.Results：1）the specific tests of Houttuynia cordata， Radix Isatidis， Flos Lonicerae， Forsythia suspensa and Scutellaria baicalensis were carried out by HPLC chromatography. the results showed that Houttuynia cordata， Radix Isatidis， Flos Lonicerae and Forsythia suspensa were found in the compound Houttuynia cordata capsule. Scutellaria baicalensis Georgi has a good specificity.2） the linear range of quercetin， phillyrin and chlorogenic acid were within the range of 4≤201 μg/mL， and the linear range of baicalin and baicalin were 12 μg/mL and 601 μg/mL， respectively. the linear range of quercetin， phillyrin and chlorogenic acid was 4≤201 μg/mL.3） the results of precision test showed that the relative standard deviation （RSD） of quercetin， phillyrin， chlorogenic acid and baicalin peak area were 0.45%， 0.52%， 0.66%， 0.59%， 0.31%， 0.51%， 0.52%， 0.56%， 0.59%， 0.31%， 0.52%， 0.62%， 0.59% and 0.31%， respectively. The results show that the precision of HPLC instrument under this chromatographic condition is good.4） The results of stability test showed that the relative peak area RSD of compound Houttuynia capsule solution was 1.33%， which indicated that the solution of compound Houttuynia capsule was basically stable within 24 hours.5） The results of reproducibility test showed that the relative peak area RSD of compound Houttuynia capsule solution was 0.92%， which indicated that the HPLC method had good reproducibility.6） The results showed that the average recovery of quercetin， eichun， chlorogenic acid， phillyrin and baicalin were 99.10%， 99.26%， 99.07%， 98.05%， 98.82%， 98.32%， 1.81% and 1.49%， respectively. 0.94%， 1.58%， 1.01%， indicating that the recovery is good.7）The results of quantitative determination based on multi-index components showed that the contents of quercetin， chlorogenic acid， phillyrin and baicalin in different batches of compound Houttuynia cordata Thunb capsules from different manufacturers were quite different.Conclusion：The results of quantitative determination based on multi-index components showed that the contents of quercetin， chlorogenic acid， phillyrin and baicalin in different batches of compound Houttuynia cordata Thunb capsules from different manufacturers were quite different. 　　Key Words Quantitative analysis of multiple index components;High performance liquid phase; Compound Houttuynia capsule;Quercetin;Biguoyichun;Chlorogenic acid;Forsythrin;Baicalin
　　中图分类号：R284.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.05.013
　　1 仪器与试药
　　1.1 仪器 高效液相色谱仪（型号：SHIMADZU LC-20AD，厂家：日本岛津有限公司）;二极管阵列（DAD）检测器（型号：Prominence SPD-M20A，厂家：日本岛津有限公司）;超声波清洗仪（型号：DS1027HT/HTD，厂家：天津市富城达科技有限公司）。
　　1.2 试剂 色谱HPLC乙腈和色谱HPLC甲醇购于德国MERCK公司，色谱HPLC冰醋酸、色谱HPLC磷酸和色谱HPLC无水乙醇均购于天津百伦斯生物有限公司;中国食品药品检定研究院提供的槲皮苷对照品（批号：111538-201405）、表告依春对照品（批号：1072-93-113531）、黄芩苷对照品（批号：0715-9909）、连翘苷对照品（批号：110821-201514）、绿原酸对照品（批号：110753-201314）。
　　1.3 分析样品 随机选取10个不同厂家生产不同批次的复方鱼腥草胶囊。
　　2 方法与结果
　　2.1 色谱条件 采用CAPCELL-PAK-MG-C18色谱柱（5 μm，规格：4.6 mm×250 mm），柱温以35 ℃为宜，进样量为10 μL，流速为1.0 mL/min进行高效液相色谱（HPLC）检测，以流动相A（乙腈）和流动相B（水+0.01%磷酸）为条件进行梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1。
　　2.2 对照品溶液的制备 首先将槲皮苷对照品、表告依春对照品、黄芩苷对照品、连翘苷对照品、绿原酸对照品均分别放置于60 ℃真空干燥至恒重，然后分别精密称取10.00 mg，其中，表告依春对照品置于100 mL量瓶中以甲醇定容，槲皮苷对照品和绿原酸对照品置于50 mL量瓶中以甲醇定容，连翘苷对照品置于25 mL量瓶中加入50%甲醇定容，黄芩苷对照品置于25 mL量瓶中加入无水乙醇适量，均超声溶解，即制备得对照品溶液。精密量取所制备2 mL槲皮苷对照品溶液和绿原酸对照品溶液、3 mL连翘苷对照品溶液、10 mL黄芩苷对照品溶液、25 mL表白依春对照品溶液于50 mL量瓶中，甲醇定容，超声混合均匀，即得混合对照品溶液。
　　2.3 供试品溶液的制备 取出复方鱼腥草胶囊的内容物，并精密称取3.0 g于20 mL的锥形瓶中，加入适量甲醇定容后以软木塞塞紧瓶口，摇晃促进内容物充分溶解均匀后记录重量，超声处理（功率500 W）30 min后，并記录溶液冷却后重量，计算两次重量差，以甲醇补齐致两次重量相等，采用0.45 μm微孔滤膜过滤混合液制成供试品溶液。
　　2.4 专属性试验 取同一供试品溶液根据2.3制备的供试品溶液，采用HPLC色谱法对复方鱼腥草胶囊中鱼腥草、板蓝根、金银花、连翘、黄芩等进行专属性试验，结果显示复方鱼腥草胶囊中鱼腥草、板蓝根、金银花、连翘、黄芩专属性良好。（由于图谱较多，此处仅以黄芩作为代表，详细见图1）。
　　2.5 线性关系考察 槲皮苷对照品、连翘苷对照品和绿原酸对照品分别精密称取10.00 mg置于50 mL量瓶中以甲醇定容，表告依春对照品、黄芩苷对照品30.00 mg置于50 mL量瓶中甲醇定容，均超声溶解，均匀混合各对照品溶液即制备得混合对照品溶液。精密量1.0、2.0、5.0、10.0、25.0 mL混合对照品溶液分别置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇晃使其混合均匀。精密吸取10 μL，根据2.1色谱条件采用HPLC色谱法，记录峰面积;以对照品的浓度（μg/mL）为横坐标（X），所测得的峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，槲皮苷回归方程y=170 121X+867，r=0.999 9（n=5）;绿原酸回归方程y=31 109X+353，r=0.999 8（n=5）;表告依春回归方程y=17 112X+42.41，r=0.999 7（n=5）;连翘苷回归方程y=33 909X+265，r=0.999 8（n=5）;黄芩苷回归方程y=95 042X+198，r=0.999 9（n=5），结果表明，槲皮苷对照品、连翘苷对照品、绿原酸对照品在4～201 μg/mL范围内、表告依春对照品、黄芩苷对照品在12～601 μg/mL范围内的线性关系均良好。
　　2.6 精密度试验 精密吸取10 μL按照2.2配制的混合对照品溶液，根据2.1的色谱条件连续进样6次，结果显示槲皮苷、连翘苷、绿原酸、表告依春对照品、黄芩苷峰面积相对标准偏差（RSD）分别是0.45%、0.52%、0.66%、0.59%、0.31%，结果表明此色谱条件下的HPLC仪器精密度良好。
　　2.7 供试品溶液稳定性试验 在室温下精密吸取10 μL同一份根据2.3配制的复方鱼腥草胶囊供试品溶液，配置后分别放置0、1、4、8、12、24 h后进样检测，结果显示复方鱼腥草胶囊供试品溶液相对峰面积RSD是1.33%，表明24 h内复方鱼腥草胶囊供试品溶液基本稳定。
　　2.8 重复性试验 精密吸取10 μL同一批次根据2.3制备的复方鱼腥草胶囊供试品溶液，在相同2.1的色谱条件下，在固定的高效液相分析仪上进样测定，重复检测5次，结果显示复方鱼腥草胶囊供试品溶液相对峰面积RSD为0.92%，表明该HPLC方法的重复性良好。
　　2.9 回收率试验 采用加样回收法，精密称取5份已知含量的同一批号样品各约0.5 g，分别精密加入20 mL混合对照品甲醇溶液（0.005 36 mg/mL），进行回收率试验测定，计算结果显示槲皮苷、表告依春、绿原酸、连翘苷和黄芩苷的平均回收率分别为99.10%、99.26%、99.07%、98.05%、98.82%、98.32%，RSD为1.81%、1.49%、0.94%、1.58%、1.01%，表明回收率较好。见表2～6。 　　2.10 样品测定结果 复方鱼腥草胶囊基于多指标成分定量结果可见，不同厂家不同批次的复方鱼腥草胶囊中有效成分槲皮苷、表告依春、绿原酸、连翘苷和黄芩苷的含量存在较大差异。见表7。
　　3 讨论
　　复方鱼腥草胶囊中所含的药物均具有清热解毒的功效，鱼腥草、板蓝根、连翘、金银花和黄芩等5味药物，相辅相成，相互作用，共奏清热解毒的作用。在中医的复方组成中，方中的每一味药物都是不可或缺，至關重要的，因此在多指标成分的选择上，本研究选择测定每一味药物的有效成分，即鱼腥草的槲皮苷、板蓝根的表告依春、金银花的绿原酸、连翘的连翘苷和黄芩的黄芩苷，而测定每一味药物的有效成分含量，对中药复方的质量优劣判定和质量控制是极其重要的[12]。因此在药物提取溶剂的选择上采用甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇作为预实验摸索条件，提取时间以0.5 h、1.0 h和1.5 h作为摸索条件，提取方式选择超声提取和回流提取2种摸索条件[13]，结果显示在超声提取下70%甲醇，提取1 h对5种药物的5种有效成分的提取效率最高。另外本研究中设计HPLC色谱法对复方鱼腥草胶囊的专属性进行鉴别研究以对其5味药物的组成进行定性的质量评价。由于组方的有效成分较多，若这些成分不具有专属性，则在其他有效成分存在的情况下，对后续成分含量的检测过程中就可能因为成分的相互影响而不可避免的造成结果偏差[14]，故而在综合样品回收率、稳定性、可重复性、精密度、线性考察的基础上，对HPLC的最佳色谱条件进行反复的试验和调整。本研究结果HPLC色谱图显示复方鱼腥草胶囊中槲皮苷、表告依春、绿原酸、连翘苷和黄芩苷的专属性良好;且在复方鱼腥草胶囊的样品检测中结果显示有效成分槲皮苷、表告依春、绿原酸、连翘苷和黄芩苷的含量存在较大差异。
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　　（2019-01-23收稿 责任编辑：王明）
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