微生物限度检查的影响因素探讨
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摘 要：结合日常工作实践，对微生物限度检查过程中影响检查结果的因素进行总结分析，并根据各个因素提出相应的应对措施，消除影响因素对检查结果的影响，保证结果的科学准确、客观公正。
关键词：微生物;限度检查;影响因素
Abstract：Based on the daily work practice， the factors affecting the results of microbial limit test were summarized and analyzed， and the corresponding countermeasures were put forward according to each factor， so as to eliminate the influence of the factors on the results of microbial limit test and ensure the scientific， accurate and objective results.
Key words：Microorganism; Limit check; Influence factors
中圖分类号：R155.5
食品和药品是人类赖以生存和发展的最基本的物质条件，食品和药品安全涉及人类最基本的权利和生命保障，更关系到国家的稳定和发展。影响食品和药品质量的因素诸多，而微生物污染是其中一个非常重要的因素，所以对微生物限度检查过程中影响检查结果的因素进行分析也就极为重要，现将日常工作实践中发现的影响因素和对应对措施进行整理分析。
1 环境与设施设备的影响
1.1 环境影响
我国药典明确规定，微生物限度检查应该在受控洁净环境下（不低于D级）的局部不低于B级单向流空气区域内进行，且洁净实验室应定期进行微生物监测，内容包括非生物活性的空气悬浮粒子数和有生物活性的微生物监测，其中微生物监测包括环境浮游菌和沉降菌监测，及关键的检测台面、人员操作服表面及五指手套等的微生物监测[1]。日常工作中，如果未对环境实施定期监测，导致环境实施未达到规定要求的，就会导致空白试验长菌，微生物结果偏离，严重的甚至出现假阳性的不合格结果。针对此情况，如果出现空白对照长菌，首先要找原因，看是环境消毒不彻底还是环境净化设施空气过滤老化漏风问题，如果是消毒问题就必须检查消毒方法方式是否合理，用紫外灭菌的检查紫外灯灭菌效果，可采用沉降菌或紫外灭菌效果指示卡验证，达不到要求就必须更换紫外灯或更换灭菌方式方法，且紫外灯离工作台面距离不能太远，如果是环境净化设施问题的就要清洗初中效或换高效过滤器，查出原因解决问题。
1.2 设备影响
微生物检测使用到的主要设备包括电子天平、培养箱、干燥箱、灭菌锅、水浴锅，生物安全柜，所用到的设备均要进行检定校准，并把检定校准结果中的偏差修正值应用到实验中，这样才能保障称取样品和整个检验过程的准确性。所有实验过程中用到的无菌器具均需要灭菌处理后才能使用，且干热灭菌和湿热灭菌的灭菌效果达到无菌要求，灭菌效果可以用灭菌指示条进行监控验证。曾经有检验同行就因为干热灭菌时不注意，导致影响最后检验结果出现不合格的假阳性，原因是其在放置灭菌用品时堆放过于密集，干热灭菌时温度不均匀导致显示温度虽然已达到灭菌温度，但是密集处未达到灭菌效果。各种菌种培养温度在标准许可范围，细菌、霉菌分开培养，厌氧培养在厌氧培养箱内进行;阳性菌必须在生物安全柜中操作，且阳性操作间与样品检测间相互独立，避免交叉污染。
2 实验人员的影响
2.1 对无菌概念理解不彻底
操作人员对操作过程无菌概念理解不彻底，导致人员自身污染。实验人员进入实验洁净区域时，要穿戴洁净工作服、鞋、帽、口罩，头发不外露，不留指甲，条件允许戴无菌手套操作，此步骤如果头发外露和留有长指甲在操作时就容易导致人为污染。
2.2 操作人员操作污染
试验操作全过程必须符合无菌技术要求，操作时尽可能在近火焰区或相对无菌区操作，取用无菌吸管加液时手不接触吸管下半部分，吸管与样品接触的下半部分至吸管尖端不接触任何外露物品，使用吸管接种于试管或培养皿时，吸管尖不得接触试管或培养皿外盖和外壁。使用吸耳球辅助吸管取样时，有的不熟练者会出现供试液接触吸耳球或液体直接进入吸耳球的情况，这个就是严重操作问题。笔者带领实习生进行检测时就出现过此问题，当时所检测样品在结果计数时发现菌落数多不可数，问题严重为结果不合格。针对此情况，笔者用送检的同批样品重新复试且平行3次实验，复试结果均为菌落总数为0，同时与实习操作人员沟通操作过程，发现问题是操作者在取样时，出现供试液吸到吸耳球内部后返回样品待测液的情况，也就是直接的污染操作。
3 检验方法的影响
药典微生物限度检查明确规定，供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确保所采用的方法适合该产品的微生物计数[1]。此验证要求针对药品微生物检验（食品检验没有明确规定）。进行检验方法的验证，即确认供试品在该试验条件下无抑菌活性或抑菌活性通过处理不影响存在微生物的计数，一般可以采取的方法有培养基稀释法、薄膜过滤法、加入中和剂或灭活剂。通过以上验证方法中的一种或多种联用消除抑菌活性，按照相关要求加入阳性菌验证微生物回收率符合规定后该方法就可以成立，作为药品生产企业是必须自己进行方法适用性验证或委托有资质的第三方进行，如果是第三方检验部门可以向生产企业索取方法适用性结论，根据结论方法进行检验。
4 培养基的影响
4.1 培养基质量
培养基自身质量直接影响检验结果的准确性，现今广泛使用培养基都是成品脱水培养基，只要严格按照产品说明书进行储存和配制，基本不会影响其成品质量。但是必须注意培养基瓶开口后，特别要注意瓶盖的密闭性，如果瓶盖未拧紧就会发生培养基吸湿结块严重的甚至发生变质，从而影响培养基的质量，如果条件允许的情况下，可以把开口后的培养基放置在除湿柜中保存。 4.2 培养基的灭菌和使用
培养基灭菌应严格按照使用说明温度条件进行，各个灭菌温度不同的培养基必须分开灭菌，不能把温度接近的培养基合并灭菌，比如把115℃和121℃灭菌温度合并一起是不可取的，如果要求煮沸即可的严禁进行高压灭菌。培养基倾注的温度和厚度也是实验正确与否的关键，灭菌后的培养基可以放置于不超过45℃的水浴锅内保温，特别注意水浴温度不得超过45℃，温度太高容易使样品中活性微生物受损或死亡，温度过低会导致琼脂发生凝固致使样品供试液混合不均匀;倾注厚度一般直径为90 mm的培养皿倾注培养基量以15～20 mL为宜，培养基太薄，在培养过程中可能因水分蒸发而影响菌落生长，培养基太厚不宜混匀，且水分太多会造成菌落蔓延生长，影响计数。如果出现水分太多产生的蔓延，除了适量的培养基外，如果仍然出现蔓延不可计数可以采用陶瓦盖法，即把培养皿的盖子换成陶瓦盖进行培养可有效去除水分的影响[3]。
5 菌落计数误差的影响
在进行菌落计数时，经验不足容易导致计数结果出现多计或漏计。因为菌落生长有大有小且形态各异，有的太小肉眼难以发现计数，有的药渣或辅料和菌落形态相似被误计入计数结果。如果菌落太小，可以借助放大鏡或菌落计数器辅助计数;如药渣或辅料和菌落形态相似的可以在培养基中加入经验证浓度的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC），其原理是TTC和活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应，生成红色的还原产物，使菌落变红色，便于菌落计数，通过颜色可以快速地把菌落和杂质区分计数，同时有效抑制部分菌落产生蔓延。笔者在日常工作中曾验证过加入培养基TTC适宜浓度为1.0～2.5 mg/100 mL[4]，该浓度范围即可使菌落变红色便于计数，同时不抑制菌落生长。
参考文献：
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2015年版 三部[S].北京：中国医药科技出版社，2005.
[2]杨 静.药品微生物限度检查法的影响因素分析[J].中国药事，2008，22（2）：1095-1096.
[3]王文丽，马庆慧.药品微生物限度检查法的影响因素及对策[J].中国医药前沿，2007，2（17）：90-91.
[4]李学兴，石 琳，梁 伟.不同浓度TTC在微生物检测培养基中的应用[J].食品安全导刊，2017（12x）：70-71.
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