分子生物学在蝗虫研究中的应用

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　　摘 要：本文综述了分子生物学方法对蝗虫的系统分类、进化关系、全基因组测序、转录组测序以及功能基因等方面的研究现状，为蝗虫研究与防治提供一定的参考。
　　關键词：蝗虫;系统发育;全基因组;功能基因
　　中图分类号：S-33
　　文献标识码：A
　　DOI：10.19754/j.nyyjs.20190630007
　　蝗虫即蝗总科昆虫的统称，归属于昆虫纲直翅目。因其地域分布广泛、杂食性、食量大、适应性强等特点是主要的农业害虫，我国有1200多种[1]，其中飞蝗能够长距离迁飞，对农业生产危害最大，飞蝗又分为群居型和散居型，群居型飞蝗危害有大于散居型，两者可发生型变。随着生物技术以及研究方法的不断更新和完善，对蝗虫的研究也逐渐从宏观转向微观，尤其对2型转变机制的研究等。
　　1 系统分类与进化关系
　　利用基因克隆技术，获得目的基因，并采用生物信息分析软件等对多样本目的基因进行比对分析、构建进化树等以此研究相互亲缘关系、进化关系。目前，用于蝗虫分类构建亲缘关系、进化关系图谱的基因有16SrDNA、18SrDNA、CoⅠ、CoⅡ基因等[2]，因上述基因序列均具有高度保守性，序列大小适中且较易通过克隆测序获得而被用于系统分类和进化分析。其原理是根据物种间的基因高度保守区域反映物种间的亲缘关系，序列的差异区域而区分种间关系。
　　1.1 16SrDNA、18SrDNA序列
　　16SrDNA是编码核糖体RNA亚基（16SrRNA）的基因，其具有高度保守性，且广泛存在于原核生物中，是分子分类最为常用的序列;18SrDNA是广泛存在于真核生物编码核糖体亚基的基因，也是分子系统发育常用序列，与16SrDNA一样具有高度保守性。截至目前，Filipenko KL[3]等人利用16SrDNA的部分序列对九种蝗虫进行系统发育关系构建。印红、张道川[4]等人获得了锥头蝗科、斑腿蝗科等蝗总科8个科的16SrDNA，并分析构建了进化树及相应的进化关系。李新江[5]等人利用16SrDNA对6种短鼻蝗构建了系统发育关系。印红等获得了18SrDNA全长序列，并以此构建了系统发育树，进一步以分子生物学手段印证了形态分类结果阐明了亲缘关系。
　　1.2 CoⅠ、CoⅡ基因
　　CoⅠ、CoⅡ基因即细胞色素氧化酶亚基1亚基和2亚基，是细胞色素氧化酶的重要组成，均存在与线粒体中，与线粒体的呼吸作用起到关键性作用，此外，此2个基因序列均较为保守，常被用作系统发育关系研究的序列。在蝗虫这一物种的研究中，黄原[6]等人通过CoⅠ基因序列的测定，对斑腿蝗科的7个种进行了系统分类研究，其研究结果与形态分类保持一致。马兰[7]等人通过CoⅡ基因片段的测定分析，对22种蝗虫进行系统发育树的构建，并对其序列进行分析，阐明其间的相互亲缘关系。肖莉莉[8]、刘艳[9]、张辰艳[10]等人分别对不同蝗虫物种线粒体基因组全长序列进行了测定与分析，为蝗虫研究提供了重要的分子基础。
　　2 全基因组测序与DNA甲基化测序
　　2.1 全基因组测序
　　随着计算机技术的不断进步以及测序平台的不断更新换代，全基因组测序逐渐趋于成熟、成本下降，全基因组测序也逐步成为实验研究的重要手段。全基因组测序是指对整个生物个体且未知其基因序列利用鸟枪法等获得整个生物个体基因序列。2014年，康乐[11]等人利用全基因组鸟枪法获得了一个经过8代近交的蝗虫雌性个体的全基因组序列，并构建了系统发育树。其研究结果表明，飞蝗基因组是目前已知动物基因组中最大的，达到6.5Gb，共包含17307个基因，这些基因也已被其他实验数据得以验证，如同源基因、RNA-seq/EST等，其中通过数据库比对发现蝗虫特有基因4571个。其研究结果还提出蝗虫基因组中存在大量重复序列，多达2639个重复序列家族，且内含子较长于其他昆虫，但外显子个数相当。通过系统进化树分析进一步印证了不完全变态为多系群，且蝗虫（直翅目）比准新翅目（蚜虫和体虱）更古老。蝗虫的全基因组的序列成功获得，将为蝗虫研究奠定分子基础，也为其他昆虫的基因组测定提供了一定的基因注释参考。
　　2.2 DNA甲基化测序
　　DNA甲基化即DNA碱基被甲基转移酶催化而转化成含有甲基的碱基，DNA甲基化通常会造成基因表达受到抑制。在早期对蝗虫的研究中，杨鹏程[12]等人利用RRBS即重亚硫酸盐测序对蝗虫全身样品和群居、散居两型脑部样品进行了甲基化测序，其结果指出，在全身样品中均存在不同程度的甲基化，4%的甲基化出现在CG位点且主要分布于外显子;在两型脑部样品中206个存在差异，此项研究也为日后蝗中生理、防治等提供了新的研究方向。
　　3 转录组测序
　　转录组指在一定条件下，所研究样本的所有转录产物，其包括mRNA、tRNA等，但实际实验研究中多为mRNA。截至目前，我国学者康乐、黄元等人先后对不同蝗虫物种，不同发育阶段进行了转录组测序并对所获得的转录本进行了分析。其中，康乐教授首次发表了飞蝗从头转录组测序结果[13]，其结果鉴别出了105种反转录子，揭示了1个 copia、1 个BEL、8 个gypsy 和23个非长末端重复反转录子，并且确定了可能参与蝗虫发育相变等相关基因，这将会为日后蝗虫的治理提供一定的分子基础。黄元等[14]利用PacBio RS II测序平台对中华稻蝗、中华剑角蝗和短额负蝗进行了转录本测序，分别获得了全长转录本35995条、32817条、41125条，其中中华稻蝗共有24955条转录本具有开放式阅读框，中华剑角蝗23161条，短额负蝗28281条，并通过注释分析获得了大量与生长发育、免疫等相关功能基因。这些大量的转录本数据不仅为日后研究蝗中生长发育等分子机制提供了数据基础，也将为研制蝗虫防治药物提供支持。
　　4 功能基因 　　4.1 化学感受基因
　　化学感受基因（Chemosensory genes，CSP）是昆虫在其生命过程中用来觅食、求偶、交流等系列行为极为关键的一类蛋白基因。飞蝗基因组中已鉴定的共有37个化学感受基因，在群居和散居蝗虫的研究中，有学者[15]阐述并证明了飞蝗的受气味诱导机制在两型转变过程中至关重要。姜峰等对两型飞蝗的CSP基因的分析表明，其在两型发育过程中表达具有显著地分布差异性，在虫卵阶段，群居性表达量要低于散居型，但随着不断发育，其表达量逐步提升。在蝗蝻与成虫阶段群居型飞蝗CSP基因表达量均较高，达到36%。
　　4.2 Hexamerin
　　Hexamerin为超家族蛋白，具有高度保守性。昆虫中的此类蛋白虽然与节肢动物的血蓝蛋白相似，但其不能像节肢动物血蓝蛋白那样能够携氧，不能与铜离子结合，而是进化成了一类能够储存、释放氨基酸的功能蛋白，起到调节营养吸收的作用[16]。目前，在飞蝗基因组中共鉴定了15个Hexamerin基因，明显高于其他昆虫，其氨基酸组成方面，谷氨酸含量中等，丙氨酸、缬氨酸含量较高[15]。
　　4.3 解毒基因及害虫防治靶点
　　在蝗虫中返现的解读相关基因主要有UDP-葡基转移酶（UDP-glycosyltransferases，UGT）、谷胱甘肽S-转移酶、3羧基/胆碱酯酶、ATP结合盒式蛋白和细胞色素P450超家族等[15]。其中UDP-葡基转移酶主要参与昆虫对之物等有毒物质进行解毒的作用，在飞蝗中已鉴定出68个UDP-葡基转移酶，这个数目明显多于其他昆虫，其序列均保持一定的相似度，且具有明显的UDP-葡基转移酶结构域。谷胱甘肽S-转移酶也具有显著地解毒功能，其主要是通过催化谷胱甘肽结合反应进而起到解毒作用。在飞蝗中，有28个谷胱甘肽S-转移酶基因，且其全部存在于细胞溶质里。羧基/胆碱酯酶是主要的杀虫剂及农药作用点，其主要通过控制外来有毒物质的解毒以及神经发育过程，在飞蝗中羧基/胆碱酯酶主要分为3类，即取食/解毒、激素/化学信息素加工和神经/发育，目前以坚定出个数分别为39、32、9。ATP结合盒式蛋白即ATP-binding cassette transporter，ABC蛋白家族是一类广泛分布于各类生物中的基因，其主要功能包括底物转运、磺脲抑制剂和核糖体组装因子等。在飞蝗中有65个家族成员，其在蝗虫中主要有杀虫剂耐受和代谢调节，其中ABCB和ABCC亚家族数目分别为19和9个，对外来毒物有解毒作用。大量证据表明P450基因与杀虫剂抗性有关，而蝗虫中有94个P450基因成员，数目要高于体虱和蚜虫，但和其他昆虫相当。
　　5 讨论
　　在分子水平，对蝗虫的研究已经取得突破性的进展，获得了大量的分子数据，例如与系统发育研究相关的的6SrDNA、18SrDNA、CoⅠ、CoⅡ基因以及线粒体基因组全场序列，飞蝗的全基因组序列、大量的不同蝗虫/不同生长发育阶段的转录组数据等，这些数据为进一步研究蝗虫的进化、型变、适应性等分子机制奠定了基础，同时也为日后在蝗虫的防治用药的研究提供了理论依据。但如此庞大的数据，尤其飞蝗基因组数据等以及功能基因、相关分子机制都有待于进一步挖掘、研究。
　　参考文献
　　[1] 董丽君. 基于COⅠ、COⅡ和COⅢ基因的蝗总科分子系统发育研究[D].河北大学，2012.
　　[2] 徐淼洋. 基于18S rRNA、16S rRNA、COⅠ、CoⅡ基因的蝗总科系统发育研究[D].河北大学，2009.
　　[3] Filipenko ML，Timofeeva OA，Gusachenko AM，et al.Reconstruction of phylogeny of locusts from the family Acridiae （Orthoptera） based on anialysis of nucleotide sequences of 16S ribosome RNA gene in mitochondria[J].Genetika，2000，36（10）：1355-1361.
　　[4] 印红，张道川，毕智丽，等.蝗总科部分种类16SrDNA的分子系统发育关系[J].遗传学报，2003，30（8）：766-772.
　　[5] 李新江，张道川，王文强，等.基于16SrDNA部分序列的6种短鼻蝗的分子系统学（直翅目蝗总科）[J].动物学报，2005，51（增刊）：138-142.
　　[6] 潘程莹，胡婧，张霞，黄原.斑腿蝗科Catantopidae七种蝗虫线粒体COⅠ基因的DNA条形码研究[J].昆虫分类学报，2006（02）：103-110.
　　[7] 马兰，黄原.基于COⅡ基因序列的斑腿蝗科部分亚科的分子系统学研究[J].昆虫学报，2006（06）：982-990.
　　[8] 肖莉莉.青脊竹蝗、云南蝗和亚洲飞蝗线粒体基因组序列测定及分析[D].陕西：陕西师范大学，2007.
　　[9] 刘艳.中华雏蝗和日本鸣蝗全线粒体基因组的测序及分析[D].陕西：陕西师范大学，2007.
　　[10] 张辰艳.中华稻蝗、长翅燕蝗和四川凸额蝗的线粒体基因组全序列的测定及分析[D].陕西：陕西师范大学，2007.
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　　[12] 杨鹏程.飞蝗基因组测序组装及组学分析[D].北京：中国科学院大学，2012.
　　[13] Feng，Jiang，Meiling，Yang，Wei，Guo，Xianhui，Wang，Le， Kang.Large-scale transcriptome analysis of retroelements in the migratorylocust， Locusta migratoria.[J].PloS one，2012，7（7）：e40532.
　　[14] 趙乐. 三种直翅目昆虫全长转录组和线粒体转录组分析[D].陕西师范大学，2018.
　　[15] 姜枫.飞蝗基因组功能解析及其比较分析[D].北京：中国科学院大学，2012.
　　[16] Burmester， T. Origin and evolution of arthropod hemocyanins and related proteins[J]. Journal of Comparative Physiology，2002，172（12）：95-107.
　　作者简介：
　　杨坤（1990-），男，硕士研究生，研究方向：蝗虫鼠害防治工作。
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