雄黄连木遗传多样性

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　　摘要：选取雄黄连木（Pistacia chinensis Bunge）为研究材料，利用10对扩增片段长度多态性（AFLP）引物对来自河南省的6个不同种群总计136份雄黄连木个体进行遗传多样性分析，从不同层次揭示其变异规律以及为后期黄连木雌雄鉴定和合理利用提供理论依据。结果表明，物种水平上，Shannon信息指数Ⅰ（0.49）和基因多样性指数（0.33）均反映出雄黄连木种群具有中等遗传多样性水平。分子方差分析（AMOVA）结果表明，雄黄连木种群内的遗传变异占93.35%，种群间的变异占6.65%，二者都说明该地区黄连木的遗传变异主要发生在种群内部。6个黄连木群体间的遗传距离范围在0.035 3～0.149 5之间，遗传相似性的范围在0.861 1～0.965 3之间，基因流Nm为2.612 6，说明黄连木不同群体间相似程度较高，遗传分化较低，基因交流较充分。
　　关键词：黄连木;AFLP;遗传变异;遗传分化
　　中图分类号： S792.990.4 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）23-0133-04
　　黄连木（Pistacia chinensis Bunge）系漆树科（Anacardiaceae）黄连木属（Pistacia）落叶乔木，雌雄异株，是广泛分布于我国的生物能源树种之一[1]。在能源危机日益加剧的今天，对生物柴油能源植物进行利用研究具有极其重要的价值与意义，黄连木作为一种优良的木本油料树种，显示出其广阔的开发利用前景，受到广泛的关注[2-3]。对于雌雄异株植物而言，一般雄株生长得更快且有更好的适应性[4]，通过对雌雄黄连木的合理搭配，来满足当前对黄连木种群大面积繁育的需要，雌雄植株黄连木性别发育很难通过形态学特征来进行鉴别，故对雄黄连木进行遗传多样性研究具有极高价值。由于过去对黄连木的研究相对落后，主要集中于栽培管养[5]、病虫害防治[6]、生理特性[7]以及资源分布[8]等方面，有关其雌雄植株遗传多样性或遗传改良的研究国内尚未见报道，李琬婷等利用9对AFLP引物对河南省4个不同种群黄连木材料进行遗传多样性分析，研究结果表明黄连木4个不同种群遗传多样性均处于中等水平，黄连木总的遗传分化主要来自居群内部，较低遗传分化则在其居群间存在[9]。
　　在随机扩增多态性标记（RAPD）和限制性片段长度多态性（RFLP）基础上不断完善发展的分子技术-扩增片段长度多态性（AFLP）标记技术，兼备RAPD与RFLP技术双重优点，可在不预知基因组序列情况下，对基因组多态性进行检测，不仅易于标准化，且所检出的多态位点同RAPD标记一样可覆盖整个基因组，也具RFLP同样的可靠性及稳定性[10]。该项技术发展至今已成功用于多种植物遗传多样性、高密度遗传图谱构建以及分子标记筛选的研究。随着分子技术的不断进步完善，AFLP技术已广泛应用于植物种质资源鉴定、遗传多态性检测、遗传图谱构建以及群体遗传结构分析等诸多方面，不仅应用在小麦、水稻、玉米等主要农作物上，在林木、果树及蔬菜等植物上也得到广泛利用[11-14]。程小毛等应用AFLP技术对6个居群的滇西北玉龙雪山不同海拔川滇高山栎进行遗传多样性分析，结果表明，6个居群的遗传多样性水平随海拔梯度的变化而呈现相同的变化规律[15]。魏朔南等通过8对引物组合将陕西漆树8个品种和6个野生居群的14个样品完全区分开[16]。本研究通过采用AFLP技术对河南省不同地域雄黄连木进行遗传多样性分析，从而为了解不同地理地域对雄黄连木遗传多样性和亲缘关系的影响，揭示其变异规律以及后期雌雄黄连木鉴定和合理利用奠定基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　试验材料为雄黄连木植株，于2015年3月在我国河南省长葛市和安阳市南沟村（西沟北坡）、南沟、南沟（东后凹）、南沟村（陈家沟）以及安阳监狱共6个地点进行采集，采集数分别为23、32、12、18、17、34株，共计136株。每株采其嫩梢 1～5个嫩枝，且取样点间距≥30 m。将采集样品迅速放进变色硅胶进行干燥处理，带回实验室常温保存备用。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 雄黄连木DNA抽提 采用改良CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法[17]提取雄黄连木基因组总DNA。
　　1.2.2 雄黄连木AFLP分析 参照李琬婷等的反应体系及反应程序[9，18]，进行AFLP相关分析。选择性扩增引物编号及序列见表1。
　　1.2.3 带型统计与数据分析 采用人工读带法，将凝胶电泳图上难以分辨的弱带或无带记作“0”，同一位置的清晰条带记作“1”，据此构建原始数据矩阵。利用POPEGENE Version1.31软件进行综合分析，计算有效等位基因数（Ne）、等位基因数（Na）、香农（Shannon）指数（I）、遗传分化系数（Gst）、Neis多样性指数（He）、基因流（Nm）以及遗传距离（D）等相关参数。采用AMOVA软件分析样品遗传变异在群体内与群体间的分布。
　　2 结果与分析
　　2.1 雄黄连木遗传多样性分析
　　利用EA16MC8、EA16MC12、EA15MC9、EA13MC5、EA13MC8、EA13MC10、EA13MC12、EA12MC15、EA11MC1、EA11MC14这10对筛选出的AFLP引物组合，对来自6个不同雄黄连木种群的136株样品进行遗传多样性分析。研究结果（表2）表明，10对引物的有效等位基因数（Ne）变异区间在1.28（EA13/MC12）～1.70（EA16/MC8），变幅为0.42，平均值为1.56;香农指数（I）最大的位点是EA16/MC8，为0.58，最小的是EA13/MC12，为0.26，平均值为0.49;而Neis基因多样性指数（He）的变化范围在0.17（EA13/MC12）～0.39（EA16/MC8），AFLP检测的结果说明雄黄连木种质资源具有中等水平的遗传多样性。 　　2.2 不同种群雄黄连木遗传多样性分析
　　由表3可知，长葛地区的种群遗传多样性水平相对其他地区较高，各项指数值均高于其他地区采样数值。其中，Neis基因多样性指数（He）长葛最高为，0.30，安阳监狱最低，为024;有效等位基因数（Ne）从高到低依次是长葛（1.53）>南沟（1.47）>南沟（东后凹）（1.46）>南沟村（陈家沟）（1.44）>南沟村（西沟北坡）（1.43）=安阳监狱（1.43）;观测等位基因数也是长葛最大，安阳监狱最小。在群体水平上，香农指数（I）平均值为0.39，Neis基因多样性指数（He）平均值为027，表明6个不同种群的雄黄连木具有中等水平的遗传多样性，其中长葛种群相对于其他种群具有较高的遗传多样性。
　　2.3 雄黄连木遗传分化
　　由表4可知，不同种群雄黄连木总基因的遗传多样性Ht为0.316 9，种群内基因多样性Hs为0.266 0，而种群间遗传分化系数Gst则为0.160 6，表明16.06%的变异存在于种群间，83.94%的遗传变异存在于种群内，雄黄连木群体间存在较低的遗传分化，总的遗传分化主要来自其种群内部。雄黄连木种群间的基因流Nm为2.612 6（>1），说明该种群间基因交流较为充分。通过AMOVA方差分析，结果显示雄黄连木种群内的遗传变异占93.35%，种群间的变异占 6.65%，说明种群内基因交流明显大于种群间基因交流。
　　2.4 雄黄连木遗传距离与相似度分析
　　由表5可得，6个雄黄连木群体间的遗传相似性区间在0.861 1～0.965 3之间，遗传距离区间在0.035 3～0.149 5之间。其中，南沟村（西沟北坡）和南沟的群体遗传距离最小（0.035 3），安阳监狱群体和南沟村（西沟北坡）群体的遗传距离最大（0.149 5）;安阳监狱和南沟村（西沟北坡）群体间的遗传相似度为最小（0.861 1），南沟村（西沟北坡）和南沟群体间的遗传相似度最大（0.965 3），说明雄黄连木群体间的遗传分化较低，不同群体间相似程度较高。
　　3 结论与讨论
　　种质资源是在自然进化过程中形成的，是自然资源的重要组成部分，蕴藏着各种性状遗传基因[19]。而植物遗传多样性主要受其分布格局以及遗传变异性高低所主导，包含了同一居群内不同个体的遗传变异、种内基因的分化以及种内不同居群间的遗传变异等[20]。对雄黄连木种质资源的遗传多样性进行研究，有利于探寻其遗传多样性丰富水平，掌握其特征及分布规律，对推动优质黄连木种质资源的挖掘利用、育种亲本的合理选配、优良基因的定位等方面具有极其重要的意义[21]。
　　本试验中利用10对AFLP引物对河南省6个不同的雄黄连木种群进行遗传多样性分析，结果显示，在群体水平上，长葛种群的有效等位基因数最高（1.53），安阳监狱以及南沟村（西沟北坡）的有效等位基因数最低（1.43），6个种群平均值为1.46，数据显示有效等位基因可能与地理位置存在一定的相关性。6个种群信息指数平均值为0.39，Neis基因多样性指数平均值为0.27，说明雄黄连木种质资源具有中等水平的遗传多样性，表明雄黄连木种质资源的遗传多样性可能与其所处的环境和位置有一定关联。这一结果与张金池等对不同地理漆树种源的遗传多样性AFLP研究相类似，该分析认为不同漆树种群与海拔标高的相关性低，但是与区域联系紧密[22]。利用这一特性，可以通过更为有效的途径来找出雄黄连木的基因交流和基因多样性方面的一系列问题，为雄黄连木遗传多样性研究提供了一定借鉴意义。此外，本研究雄黄连木种群的遗传多样性水平与前人对黄连木种群遗传多样性研究结果[23-24]相似，说明雄黄连木种群和雌雄混合的黄连木种群一样具有较强的适应能力[25]。种群间遗传分化系数Gst为0.160 6，表明16.06%的变异存在于种群间，83.94%的遗传变异存在于种群内，这说明雄黄连木群体间存在较低的遗传分化，而总遗传分化主要来自于其群体内部。雄黄连木种群间基因流Nm为2.612 6（>1），说明该种群间基因交流较充分。表明雄黄连木的种群间的基因交流相对不足，但在种群内的基因交流和遗传變异比例相对较高，大多基因变异存在于种群内。遗传分化主要是由居群本身的遗传特性所控制[26]，如不同的花粉、种子传播方式，生物以及非生物因子，尤其是人为干扰所引起的遗传变异、地理隔离等;物种的遗传多样性和其分布范围间也存在明显的相关性，与狭域种相比，广布种并不容易受到遗传漂变的作用，故其遗传分化通常较低[27-28]。
　　本研究中，黄连木为雌雄异株乔木，风媒传粉，其花粉和种子的传播受到重力、风力等因素的交互影响，隔离距离越小，群体间的基因流越大，从而导致雄黄连木群体间的遗传分化程度降低[15，29]。AMOVA结果表明，种群内的遗传变异占93.35%，种群间的变异占6.65%。进一步证明黄连木的种群间基因交流较少，主要以种群内的基因交流为主，并最终影响遗传结构的形成。6个雄黄连木种群间的遗传相似性的范围在0.861 1～0.965 3之间，遗传距离范围在0.035 3～0.149 5 之间。这一结果阐明黄连木不同种群间相似程度较高，种群间的遗传分化较低。
　　本研究通过对雄黄连木的遗传多样性进行综合分析，有利于发现其遗传分化特性，为后期研究基因与含油量关系奠定基础。随着生物技术水平和研究手段的进步发展，AFLP标记技术在雄黄连木的品种遗传多样性和亲缘关系分析、优良种质基因的挖掘、新品种的选育和保护以及种质创新等方面有广阔的应用前景。
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　　收稿日期：2018-08-21
　　基金项目：国家自然科学基金（编号：31100292）;云南省自然科学基金（编号：2010ZC267）;云南省省级重点学科园林植物与观赏园艺建设经费（编号：50097401）。
　　作者简介：李琬婷（1993—），女，云南昆明人，硕士，主要从事园林植物应用研究。E-mail：2861283663@qq.com。
　　通信作者：程小毛，博士，副教授，主要从事林木遗传育种研究。E-mail：30375713@qq.com。
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