青钱柳叶片中总黄酮的提取方法研究

来源:用户上传      作者:

　　摘要 [目的]研究青钱柳叶片中总黄酮的提取方法。[方法]通过超声波辅助水醇提取法提取总黄酮，以乙醇浓度、料液比、超声波功率密度、提取时间为考察因素，以得到的总黄酮含量为指标，在单因素试验的基础上进行正交试验，研究青钱柳叶片中总黄酮的最佳提取条件。[结果]提取青钱柳叶子中总黄酮的最佳提取条件为乙醇浓度70%、料液比1∶80（g∶mL）、超声波功率密度为50%、提取时间40 min，在此条件下总黄酮提取率为2.95%。[结论]该研究为工业生产提取总黄酮提供了参考依据。
　　关键词 青钱柳;叶片;总黄酮;超声波辅助水醇提取;正交试验
　　中图分类号 R284.2  文献标识码 A  文章編号 0517-6611（2020）05-0179-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.050
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Abstract [Objective]The research aimed to study the extraction method of total flavonoids from Cyclocarya paliurus leaves.[Method]The total flavonoids were extracted by ultrasonicassisted hydroalcoholic extraction method，taking ethanol concentration， materialliquid ratio， ultrasonic power density and extraction time as factors， and using the obtained total flavonoids as an index， an orthogonal test was performed on the basis of the single factor test to study the optimal extraction conditions of total flavonoids from Cyclocarya paliurus leaves.[Result]The optimal extraction conditions for total flavonoids from Cyclocarya paliurus leaves were： ethanol concentration of 70%， materialliquid ratio of 1∶80， ultrasonic power density of 50%， and extraction time of 40 minutes. Under these conditions， the total flavonoid extraction rate was 2.95%. [Conclusion]The research provides a reference for extracting total flavonoids for industrial production.
　　Key words Cyclocarya paliurus;Leaves;Total flavonoids;Ultrasoundassisted wateralcohol;Orthogonal test
　　青钱柳（Cyclocarya paliurus）属于双子叶植物纲胡桃科青钱柳属，该属下只有青钱柳一种，零散分布于中国南部山区，目前属国家重点保护的濒危植物之一[1]。青钱柳叶中富含的水提物和醇提物（黄酮），能够有效地调节人体糖代谢，激活胰岛器官功能，可以起到降血糖的作用[2]。对于黄酮的提取方法主要有索氏提取法、有机溶剂提取法、微波提取法[3]、超临界流体萃取法[4]、超声波辅助提取法等。超声波辅助提取法提取黄酮类物质，是目前比较新的方法。超声波是一种具有波动与能量双重属性的机械波，它是利用超声波所具有的热效应、机械效应、空化效应，通过增大介质的穿透力、增大介质分子的运动速度来提取生物有效成分，可以加快提取进程，促进植物体中有效成分的溶解，提高药物有效成分的提取率[5-7]。该试验采用超声波辅助提取法对青钱柳叶片中总黄酮进行提取，以期研究出最佳提取条件。
　　1 材料与方法
　　1.1 试材
　　青钱柳新鲜叶子;芦丁标准品（安徽酷尔生物工程有限公司）;无水三氯化铝（天津市大茂化学试剂厂）;无水乙醇;所用试剂均为分析纯。
　　1.2 仪器
　　SB-5200 DTD 超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）;UV-5100紫外可见分光光度计（METASH上海元析仪器有限公司）;粉碎机（COSUAI永康市天祺盛世工贸有限公司）。
　　1.3 标准曲线的绘制
　　准确配制0.3 mg/mL 芦丁标准液和1%的三氯化铝乙醇溶液，用80%乙醇定容。精确吸取0.3 mg/mL芦丁标准液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于1～6号10 mL容量瓶中，待用;在1～6号容量瓶分别加入1 mL 1%的三氯化铝乙醇溶液，用80%乙醇定容，放置15 min。1号管为对照组。该试验中，样品在415 nm波长有最大吸收峰，因此选择415 nm作为测定波长。用1号溶液对分光光度计进行调零，随后分别对2～6号溶液进行3次测定，记录每次的吸光度，最后分别取平均值;以芦丁浓度（X）对吸光度（Y）作图，得出回归方程为Y = 30.091X-0.030 8（R.2=0.998 9）。
　　1.4 试验方法 在单因素试验的基础上，采用L9（3.4）正交设计，以青钱柳总黄酮的提取率为指标，探讨乙醇浓度、料液比、超声波功率密度、提取时间4个因素对提取率的影响。 　　试验流程：新鲜青钱柳叶子→干燥→粉碎→称取样品→按照料液比加入提取液（不同浓度的乙醇）→超声波提取→过滤→定容→测定。
　　测定方法：往样品中加入螯合剂（1%三氯化铝乙醇溶液），放置15 min后，在415 nm波长的分光光度计下测定各样品吸光度，记录吸光度，分别取平均值;由回归方程求出稀释液中总黄酮浓度，然后计算青钱柳总黄酮的含量。
　　2 结果与分析
　　2.1 超声波辅助水醇提取青钱柳叶总黄酮单因素试验
　　2.1.1 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响。在超声波清洗仪功率密度75%、提取时间30 min、料液比为1∶20时，考察不同乙醇浓度（40%、50%、60%、70%、80%）对青钱柳叶片总黄酮提取率的影响。从图1可以看出，在试验条件下，当其他提取条件固定时，乙醇的浓度越高，总黄酮的量就越多，在用60%～80%的乙醇浓度提取时，总黄酮提取率的变化趋势比较平缓，说明提取的用量已经接近饱和状态。结合经济效益，提取总黄酮的乙醇浓度以60%为最优选择。
　　2.1.2
　　料液比对总黄酮提取率的影响。在超声波清洗仪功率密度75%、提取时间30 min、乙醇浓度60%时，考察不同料液比（1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100）对青钱柳叶片总黄酮提取率的影响。从图2可以看出，在试验条件下，当其他提取条件固定时，随着料液比的提高，总黄酮提取率先随之升高，当料液比为1∶60时，总黄酮提取率最大，之后有所下降。推断原因是增加溶剂的剂量时，增大了溶质推动力，有利于黄酮类物质的溶出，青钱柳总黄酮提取率明显提高，当溶剂量继续增多时，杂质成分溶出增多，影响了黄酮类物质的浸出，故随后的总黄酮提取率有所下降。提取液量过少不利于后期过滤工作，黄酮损失率也较大[8]。因此选择料液比1∶60为最佳。
　　2.1.3 超声波清洗仪功率密度对总黄酮提取率的影响。在料液比1∶40、提取时间30 min、乙醇浓度60%时，考察不同超声波清洗仪功率密度（50%、60%、70%、80%、90%）对青钱柳叶片总黄酮提取率的影响。从图3可以看出，在试验条件下，当其他提取条件固定时，超声波清洗仪功率密度为60%和70%时，总黄酮提取率达到最大值。分析其原因是一开始随着功率密度的增加，对细胞壁的破坏作用逐渐增强，这促进了总黄酮的溶出，使其提取率逐渐增加，但当功率密度大于70%时，引起局部高温，会破坏总黄酮的结构，使其提取率下降。因此超声波清洗仪功率密度选择60%为宜。
　　2.1.4 提取时间对总黄酮提取率的影响。在料液比1∶40、超声波清洗仪功率密度为75%、乙醇浓度60%时，考察不同提取时间（10、20、30、40、50 min）对青钱柳叶片总黄酮提取率的影响。从图4可以看出，当其他提取条件固定时，提取时间为40 min时，总黄酮提取率最大，之后有所下降。分析其原因在于提取的前期，细胞内总黄酮快速扩散到溶剂中，使得其提取率显著增加。大于40 min后，由于长时间的超声波机械效应和热能效应对总黄酮结构产生破坏，同时又造成细胞内其他杂质扩散进入溶剂中，使得总黄酮提取率下降。因此提取时间选择40 min为宜[9]。
　　2.2 正交试验对提取方法参数的优化
　　单因素试验是在各个因素相互不影响的情况下所得到的结论，但实际提取的过程中所存在的变量都是相互影响的，利用单因素试验结果选取正交试验的最优范围，方便试验数据的整理，故在单因素试验的基础上，采用L9（3.4）正交设计，进行正交试验，设计参数为乙醇浓度、料液比、超声波清洗仪功率密度、提取时间4个参数（表1）;设计梯度参照单因素试验的代表梯度，以青钱柳叶总黄酮提取率为指标进行提取方法参数的优化。
　　 从表2可以看出，超声波辅助提取青钱柳叶总黄酮过程中的各个变量因素影响程度不同，各因素的影响程度从大到小依次为料液比、提取时间、乙醇浓度、超声波清洗仪功率密度。正交试验所得最佳条件为A3B3C2D1，即料液比1∶80，乙醇浓度为70%，提取时间为40 min，超声波功率密度为50%，在此提取条件下，总黄酮的提取率为2.95%。
　　3 结论与讨论
　　关于青钱柳叶子中总黄酮的提取方法报道较少，该试验对总黄酮的提取方法进行研究，对比传统的酶解法提取[10]，超声波辅助水醇提取法所运用的化学物质少;对比超临界流体萃取法，其操作简单;对比索氏提取法，超声波辅助水醇提取法所运用的时间更短。超声波辅助水醇提取法适用于食品工业生产，安全且成本较低，操作容易。
　　单因素试验表明，各个因素在相互不影响的情况下提取青钱柳叶片中总黄酮的最佳条件为乙醇浓度60%、料液比1∶60、超声波功率密度为60%、提取时间为40 min。但实际提取的过程中所存在的变量都是相互影响的，故利用单因素试验结果选取正交试验的最优范围进一步进行了正交试验。正交试验结果表明，料液比的影响最大，其次是提取时间、乙醇浓度，超声波清洗仪功率密度的影响最小。超声波功率太强或者提取时间过长均会影响总黄酮的稳定性，导致提取率降低。提取青钱柳叶片中总黄酮的最佳条件为乙醇浓度70%，料液比1∶80，超声波功率密度为50%，提取时间为40 min，在最佳提取条件下，总黄酮的最终提取率为2.95%。
　　参考文献
　　[1]方升佐，洑香香.青钱柳资源培育与开发利用的研究进展[J].南京林业大学学报（自然科学版），2007，31（1）：95-100.
　　[2]黄敬耀，楼兰英，徐膨.摇钱树叶的药理研究（简报）[J].中药通报，1986，11（11）：61.
　　[3]周欣，卫培峰，王丽平，等.沙棘叶和果实中总黄酮提纯工艺研究进展[J].亚太传统医药，2019，15（3）：188-190.
　　[4]王志锋，王青.超临界流体萃取技术在中药提取中的应用[J].科技与创新，2018（14）：13-15.
　　[5]谷盼盼，王芳梅，张鑫，等.超声波辅助提取黑果枸杞中油脂的工艺研究[J].中国食品添加剂，2019，30（3）：120-126.
　　[6]熊海濤，郑行望，唐志华.多酚氧化酶催化法间接测定连苯三酚[J].宝鸡文理学院学报（自然科学版），2010，30（4）：53-56，70.
　　[7]李银平.微波及超声波辅助提取葡萄籽多酚与提取液特性表征的研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2012.
　　[8]郭莹，周颖，毕海丹，等.响应面优化超声波-微波协同提取凤眼莲黄酮工艺及其不同部位黄酮抗氧化活性分析[J].食品工业科技，2019，40（1）：168-174.
　　[9]李志.超声波提取薏苡仁中总黄酮工艺及抗氧化活性的研究[J].四川理工学院学报（自然科学版），2019，32（1）：16-23.
　　[10]陈雪婷，徐文杰，李智勇.酶解法辅助提取布渣叶总黄酮的工艺优选[J].湖南中医杂志，2018，34（10）：176-179.
转载注明来源:https://www.xzbu.com/1/view-15152440.htm