制川乌高压蒸法炮制工艺优化研究

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　　摘要 [目的]对制川乌高压蒸法炮制工艺进行优化研究。[方法]选取影响制川乌质量的关键工艺步骤进行单因素试验，根据单因素考察的结果进行正交试验，以双酯型生物碱总量、单酯型生物碱总量为考察指标，得到最佳炮制工艺，并进行验证性试验。[结果]制川乌最佳炮制工艺为清水浸泡6 h，高压蒸制60 min，切片，60 ℃烘干。[结论]该研究为制川乌炮制工艺的规范化、质量标准的提高以及临床用药质量的保障提供参考。
　　关键词 制川乌;高压蒸法;炮制工艺;优化;双酯型生物碱;单酯型生物碱
　　中图分类号 R283  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2020）05-0172-04
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.048
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Abstract [Objective]The research aimed to optimize the high pressure steaming processing technology of Aconiti Radix Cocta.[Method]The key process steps that affect the quality of Aconiti Radix Cocta were selected for singlefactor tests， and orthogonal tests were performed based on the results of singlefactor investigations. The total amount of diester alkaloids and the total amount of monoester alkaloids were used as indicators to obtain the best processing technology and carry out confirmatory tests.[Result]The best processing technology of Aconiti Radix Cocta was soaking for 6 h， steaming at highpressure for 6 min， cuting into slices， drying at 60 ℃. [Conclusion]The study provides experimental reference for the standardization of the processing technology， the improvement of the quality standard and the quality assurance of clinical drug use，
　　Key words Aconiti Radix Cocta;High pressure steaming method;Processing technology;Optimizations;Diester alkaloids;Monoester alkaloids
　　川烏是一种常用中药，为毛茛科植物乌头（Aconitum carmichaelii Debx.）的干燥母根，其商品主要是栽培品，是较为重要的药用农业经济作物。川乌药用历史悠久，《神农本草经》即有记载;其味辛、苦、性热，具有祛风除湿、温经止痛的功能，用于风寒湿痹、关节疼痛、心腹冷痛、寒疝作痛及麻醉止痛[1]。川乌临床应用较广，但因其有大毒，自古以来便需通过炮制，将其所含毒性强的乌头碱、次乌头碱、新乌头碱等双酯类生物碱成分降解为毒性弱的苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱等单酯类生物碱成分，从而使毒性降低至适宜程度方予使用。历代所用的川乌炮制方法众多，如煨制、盐制、黑豆蒸、水浸等，不下30种[2]。历史上川乌炮制方法虽多，但新中国成立后，被《中国药典》这一法定国家药品标准收载的只有1种（即制川乌），其炮制方法为：取川乌，大小个分开，用水浸泡至内无干心，取出，加水煮沸4～6 h（或蒸6～8 h）至取大个及实心者切开内无白心，口尝微有麻舌感时，取出，晾至六成干，切片，干燥[1]。有关制川乌炮制方法研究的论文已有一些[3-9]，其中亦有采用高压蒸法，但或因采用的炮制过程与《中国药典》存在差异，或因只进行了单因素考察，故都存在一些不适合饮片生产企业工业化生产的情况。笔者从法规依从性出发，完全遵循《中国药典》规定的炮制方法，并结合企业实际生产条件，对制川乌高压蒸法炮制工艺进行研究，明确了关键工艺参数并达到了工业化生产的要求，确保了制川乌产品质量的均一、稳定、可控。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 主要仪器。BSA225S-CW分析天平（德国赛多利斯集团）;DMF-4B手提式高速中药粉碎机（浙江温岭市铭大药材机械设备有限公司）;GZX-9070 MBE型数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）;KSW型电阻炉温度控制器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）;RV10控制型立式旋转蒸发仪[艾卡（广州）仪器设备有限公司];KQ-300DA数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;YXQ-LS-18SI压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）;UltiMate 3000型高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技公司）。
　　1.1.2 试材。川乌药材产于四川江油，经广州中医药大学高明副教授鉴定为毛茛科植物乌头（Aconitum carmichaelii Debx.）的干燥母根;经检验其双酯型生物碱含量（即乌头碱、次乌头碱和新乌头碱的总量）为0.064%、水分9.7%、总灰分7.0%、酸不溶性灰分1.2%，均符合《中国药典》2015年版规定。 　　1.1.3 主要试剂。异丙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、氨水，AR，均购自广州化学试剂厂;乌头碱（批号110720-201111）、次乌头碱（批号110798-201308）、新乌头碱（批号110799-201608）、苯甲酰乌头原碱（批号111794-201102）、苯甲酰次乌头原碱（批号111796-201303）、苯甲酰新乌头原碱（批号111795-201303），均购自中国药品生物制品检定研究所。
　　1.2 方法
　　1.2.1 对照品溶液的制备。取苯甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰次乌头原碱对照品、苯甲酰新乌头原碱对照品、乌头碱对照品、次乌头碱对照品及新乌头碱对照品适量，精密称定，加异丙醇-三氯甲烷（1∶1）混合溶液制成每1 mL含苯甲酰乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱各50 μg、苯甲酰新乌头原碱0.3 mg的混合溶液及每1 mL含乌头碱50 μg、次乌头碱和新乌头碱各0.15 mg的混合溶液，即得[10-12]。
　　1.2.2 供试品溶液的制备。取制川乌粉末（过3号筛）约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氨试液3 mL，精密加入异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，称定重量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz;水温在25 ℃以下）30 min，放冷，再称定重量，用异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25 mL，40 ℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入异丙醇-三氯甲烷（1∶1）混合溶液3 mL溶解，滤过，取续滤液，即得[10-12]。
　　1.2.3 色谱分析条件。色谱柱：資生堂Superiorex ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相：乙腈-四氢呋喃（25∶15）（A）-0.1 mol/L醋酸铵溶液（每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL）（B），梯度洗脱（0～48 min，15%～26% A;48～49 min，26%～35% A;49～58 min，35% A;58～65 min，35%～15% A）;流速0.8 mL/min;检测波长235 nm;柱温27 ℃;进样量10 μL。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于2 000。
　　1.2.4 方法学考察。
　　1.2.4.1 线性关系的考察。取“1.2.1”项下的对照品溶液，分别按照“1.2.3”方法进样2、4、6、10、15、20 μL，记录色谱图，以进样浓度X（μg/mL）为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程。
　　1.2.4.2 稳定性试验。取按“1.2.2”方法制备的供试品溶液6份，按“1.2.3”色谱分析条件分别于0、2、4、6、8 h进样，进样量10 μL，测定乌头碱等6个物质的峰面积积分值，计算RSD。
　　1.2.4.3 精密度试验。取按“1.2.1”方法制备的对照品溶液，按“1.2.3”色谱条件连续进样6次，计算乌头碱等6个物质峰面积的RSD值。
　　1.2.4.4 重复性试验。取按“1.2.2”方法制备的供试品溶液6份，按“1.2.3”色谱分析条件进样，进样量为10 μL，测定乌头碱等6个物质的峰面积，计算RSD。
　　1.2.4.5 加样回收试验。取按“1.2.2”方法制备的供试品溶液6份，精密称量，测定其样品所含单酯型生物碱含量，分别加入苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱对照品溶液各1 mL，按“1.2.2”方法制备成供试品溶液，测定3种单酯型生物碱含量，并计算回收率和RSD。
　　1.2.5 样品的含量测定。按“1.2.2”方法分别精密称取制川乌饮片粉末配制成供试品溶液各2份，按“1.2.3”方法对样品进行含量测定，计算得出双酯型生物碱、单酯型生物碱含量。
　　1.2.6 单因素试验。
　　1.2.6.1 浸泡时间。取川乌药材4份（每份约1 000 g），分别置于适宜容器中，用水分别浸泡6、12、18、24 h，取出，置蒸制容器内120 ℃高压蒸制60 min后取出，切片，60 ℃烘干。按“1.2.5”方法对样品进行含量测定。
　　1.2.6.2 蒸制时间。取川乌药材3份（每份约1 000 g），分别置于适宜容器中，用水分别浸泡6 h后取出，置蒸制容器内分别在120 ℃高压蒸制30、60、90 min后取出，切片，60 ℃烘干。按“1.2.5”方法对样品进行含量测定。
　　1.2.6.3 干燥温度。取川乌药材4份（每份约1 000 g），分别置于适宜容器中，用水分别浸泡6 h，取出，置蒸制容器内120 ℃高压蒸制60 min后取出，切片，分别在40、50、60、70 ℃下烘干。按“1.2.5”方法对样品进行含量测定。
　　1.2.7 正交试验。根据上述对工艺的单因素考察，选取影响比较大的3个因素进行正交考察。以浸泡时间、蒸制时间和干燥温度为考察因素，以双酯型生物碱总量、单酯型生物碱总量为指标，按L9（3.4）正交表安排试验，对制川乌的工艺进行正交优化。
　　1.2.8 验证试验。按上述正交优化工艺得到的最佳工艺进行3次验证试验，每次投料净川乌饮片10 kg，分别取样测定并计算含量。
　　2 结果与分析
　　2.1 方法学考察
　　2.1.1 线性关系的考察。按“1.2.4.1”方法操作，以进样浓度X（μg/mL）为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，计算得线性方程分别为苯甲酰乌头碱Y=0.032 8X+0.000 2（R.2=0.999 1）、苯甲酰次乌头碱Y=0.016 3X+0.000 1（R.2=0.999 7）、苯甲酰新乌头碱Y=0.043 8X+0.005 2（R.2=0.999 6），表明3种单酯型生物碱在对应含量范围内有良好的线性关系;乌头碱回归方程为Y=0.026 6X-0.005 4（R.2=0.999 2），次乌头碱回归方程为Y=0.037 2X-0.005 9（R.2=0.999 7），新乌头碱的回归方程为Y=0.035 8X+0.005 8（R.2=0.999 5）。 　　2.1.2 稳定性试验。按“1.2.4.2”方法操作，测得乌头碱等6个物质的峰面积的RSD为0.65%～1.34%，表明样品在8 h内性质稳定。
　　2.1.3 精密度试验。按“1.2.4.3”方法操作，计算得峰面积的RSD为0.57%～1.12%，表明在此试验条件下精密度良好。
　　2.1.4 重复性试验。按“1.2.4.4”方法操作，计算得RSD为0.83%～1.41%，表明该方法重复性良好。
　　2.1.5 加样回收试验。按照“1.2.4.5”方法操作，计算出苯甲酰乌头原碱的加样回收率为95.6%，RSD为0.88%;苯甲酰次乌头原碱的加样回收率为98.3%，RSD为0.72%;苯甲酰新乌头原碱的加样回收率为97.1%，RSD为1.07%;乌头原碱的加样回收率为100.2%，RSD为0.98%;次乌头原碱的加样回收率为94.6%，RSD为1.02%;新乌头原碱的加样回收率为98.1%，RSD为0.84%，表明含量测定的方法稳定可靠，可用于制川乌的含量检测。
　　2.2 单因素试验
　　2.2.1 浸泡时间。按“1.2.6.1”方法操作，计算得出不同浸泡时间条件下制川乌的含量，测定结果如表1所示。
　　由表1可知，浸泡6 h时，单酯型生物碱总量最高，且随着浸泡时间的增加，单酯型生物碱总量减少。
　　2.2.2 蒸制时间。按“1.2.6.2”方法操作，计算得出不同蒸制时间条件下制川烏的含量，测定结果如表2所示。由表2可知，高压蒸制60 min时，单酯型生物碱总量最高。
　　2.2.3 干燥温度。按“1.2.6.3”方法操作，计算得出不同干燥温度条件下制川乌的含量，测定结果如表3所示。
　　由表3可知，60 ℃干燥时，单酯型生物碱总量最高。
　　2.3 正交试验 按“1.2.7”方法操作，因素水平见表4，正交试验设计见表5。
　　从表5可以看出，以双酯型生物碱总量为指标时，各影响因素均无显著性;以单酯型生物碱总量为指标时，蒸制时间具有显著性;无论是以双酯型生物碱总量还是以单酯型生物碱总量为指标，均是蒸制时间的R值最大，且明显高于其他2个影响因素。从极差分析结果可以看出，以双酯型生物碱总量为指标时，各影响因素不同水平的顺序为A1>A2>A3，B2=B3>B1，C2=C3>C1;以单酯型生物碱总量为指标时，各影响因素不同水平的顺序为A1>A3>A2，B2>B1>B3，C2>C3>C1;二者虽有不同，但A1、B2、C2均为相应影响因素各水平中最大者。综合分析考虑，确定制川乌的最佳炮制工艺为A1B2C2，即浸泡6 h，蒸制60 min，在60 ℃温度下烘干。
　　2.4 验证试验 按“1.2.8”方法操作，计算同一炮制方法下3个批次的制川乌含量，测定结果见表6。
　　3 结论与讨论
　　结合生产实际，该研究选取浸泡时间、蒸制时间、干燥温度这3个因素进行单因素考察，并进一步挑选这3个因素不同水平，对制川乌炮制工艺进行正交试验。在车间的实际生产工艺中，水浸天数在6～24 h，故水浸时间初步确定在6、12、18 h 3个水平上。在考虑节省原料及可行性上，确定高压蒸制时间为30、60、90 min。参考药典及其他文献，选择50、60、70 ℃作为干燥温度的3个水平。结果表明，制川乌的最佳炮制工艺为：清水浸泡6 h，高温蒸制60 min，60 ℃烘干。验证结果表明，经该方法炮制后，双酯型生物碱的含量未超过限量，单酯型生物碱含量高于生品，其他检测项目均符合药典标准，可见该炮制方法有利于川乌的减毒增效。依据该研究方法进行进一步验证，制川乌的品质得以提升，同时为大规模生产提供了理论基础和依据。
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