加味净屑饮对咪喹莫特诱导的银屑病小鼠的治疗作用及IL-17产生的影响

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　　【摘 要】 目的：研究加味净屑饮对咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型的治疗作用及IL-17产生的影响。方法：通过咪喹莫特诱导银屑病样的小鼠模型，随机分为模型组、阳性药物及加味净屑饮低剂量组（3g/kg）、加味净屑饮中剂量组（6g/kg）、加味净屑饮高剂量组（12g/kg）组，另设空白对照组;游标卡尺检测左耳厚度;HE染色检测银屑病样皮损炎症状况。ELISA法测定模型小鼠血清Th17细胞细胞因子（IL-17）的表达水平。结果：加味净屑饮高剂量药物干预显著降低咪喹莫特诱导的模型小鼠左耳厚度（P<0.01），减少左耳炎症细胞的浸润，降低咪喹莫特诱导的模型小鼠血清IL-17的表达水平（P<0.05）。结论：加味净屑饮对咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型有较好的治疗作用，其机制可能与抑制IL-17的产生有关。
　　【关键词】 银屑病;加味净屑饮;Th17细胞;IL-17
　　【中图分类号】R285.6   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2020）5-0006-03
　　银屑病是一种遗传与环境共同作用诱发、免疫介导的慢性、复发性、炎症性、系统性疾病[1]。临床上常反复难愈，影响患者生活质量。从病理学上看，角质形成细胞增殖和分化的异常，角质层中性粒细胞聚集所形成的Munro微脓疡以及真皮浅层血管周围以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润是银屑病的3个最主要的特点[3]。研究表明，在银屑病的炎症反应中，Th17细胞及其分泌的IL-17等对炎症免疫有着至关重要的作用[3]。本病属中医“白疕”的范畴。笔者应用加味净屑饮治疗血热证寻常型银屑病，取得良好临床疗效[4]，为进一步为临床使用提供客观的实验依据，笔者进一步研究加味净屑饮对咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型的治疗作用及IL-17产生的影响，现报告如下。
　　1 实验材料
　　1.1 实验动物 来源，种系，品系：BALB/c小鼠，7～8周龄，体重20～22g，雌性，成都达硕生物科技有限公司提供，合格证号：SCXK（川）2008-24。上述动物饲养于动物实验屏障系统，饲养一周后使用。温度（22±1）℃，湿度（55±5）%，12 h光暗循环。饲料和水均在消毒后由动物自由摄取。
　　1.2 药物与试剂 加味净屑饮组成（60kg成人劑量）：水牛角粉30g，生地15g，紫草15g，白鲜皮15g，漏芦根15g，鸡血藤15g，白花蛇舌草20g，茜草根10g，威灵仙10g，苍术10g，板蓝根15g，苦参15g，玄参15g，昆明山海棠15g等，药物来自于昆明市中医医院中药房。加入10倍的水，浸泡30min，然后煎煮3次，合并煎煮液，纱布过滤、离心后，旋转蒸发仪进行蒸发，最后浓缩成浸膏， 称取质量，折合原药材1g浸膏相当于2.57g生药。根据人与动物间药物剂量换算比例换算成小鼠剂量，制定出给药浓度。咪喹莫特乳膏购自湖北科益药业股份有限公司（生产批号190801），地塞米松片购自国药集团容生制药有限公司（生产批号1509202），IL-17 ELISA检测试剂盒购自美国Invitrogen公司（生产批号210754003），其他试剂为国产分析纯。
　　1.3 主要仪器设备 离心机来自德国Thermo Scientific Heraeus;石蜡切片机、组织包埋机、烘片机、DM2500正置显微镜、全自动组织脱水机均购置德国莱卡仪器有限公司，酶标仪购自美国Bio-Tek公司。
　　1.4 实验方法
　　1.4.1 实验分组及干预 48只BALB/c雌性小鼠，平均体重18～20g，将其随机分为6组：空白对照组、模型组、加味净血饮低、中、高剂量组（分别为相当于生药3g/kg、6g/kg和12g/kg）及地塞米松阳性对照组（2mg/kg），每组8只。将小鼠耳部的被毛小心剃去，将5%的咪喹莫特乳膏均匀涂抹于耳部，用药量为10mg，1次/d，连续用药5d。空白对照组涂抹相同体积的蒸馏水。给药组灌胃给予相应加味净血饮，灌胃体积为0.4mL/只，空白对照组、模型组灌胃相同体积的生理盐水。
　　1.4.2 左耳厚度检测 使用游标卡尺测量各组小鼠背左耳皮肤厚度，测量3次，取平均值，于给药第1天、第3天、和第5天下午3点测量左耳厚度。
　　1.4.3 HE染色法观察皮肤的病理损伤程度 取材之后标本放入4%的多聚甲醛溶液中固定，通过包埋，切片，烘干，脱蜡，水化，HE染色等步骤制成透明的组织切片，在倒置光学显微镜下观察各组小鼠皮肤的组织结构及炎症细胞浸润情况，并用数码相机采集图像。
　　1.4.4 ELISA法模型小鼠血清中的IL-17产生水平 收集血清样本，采用ELISA法测定各组小鼠血清中的IL-17细胞因子的水平，各步骤按照试剂盒操作说明书进行。
　　1.4.5 统计学处理 采用SPSS20.0软件进行统计分析，计量资料采用均数加减标准差（x±s）进行描述，两组间均值的比较采用t检验，方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
　　3 结果
　　3.1 加味净屑饮对咪喹莫特诱导的模型小鼠左耳厚度的影响 实验结果显示，随着造模时间推移，与空白对照组比较，模型组小鼠左耳厚度显著增加，在第3天和第5天差异有统计学意义（P<0.05），提示造模成功;与模型组比较，地塞米松阳性对照组和加味净屑饮高剂量组药物干预于第3天和第5天显著降低咪喹莫特诱导的模型小鼠左耳厚度，差异具有高度统计学意义（P<0.01）。结果见表1。 　　3.2 加味净屑饮对咪喹莫特诱导的模型小鼠左耳病理损伤的影响 HE 染色显示，空白对照组小鼠耳部皮肤表皮层菲薄，细胞形态正常。与空白对照组比较，模型组耳朵皮肤明显增厚，炎症细胞浸润明显;与模型组比较，地塞米松阳性对照组和加味净屑饮不同剂量组药物干预，显著降低皮肤厚度，炎症细胞浸润减少，阳性对照组和高剂量组效果更好。如图1所示。
　　3.3 加味净屑饮对咪喹莫特诱导的模型小鼠IL-17产生水平的影响 ELISA检测结果显示，与空白对照组比较，模型组小鼠血清IL-17显著升高;与模型组比较，加味净屑饮高剂量组药物干预下调咪喹莫特诱导的模型小鼠血清Th17细胞细胞因子（IL-17）的表达水平，差异具有高度统计学意义（P<0.01）。如图2所示。
　　4 讨论
　　银屑病是一种遗传与环境共同作用诱发、免疫介导的慢性、复发性、炎症性、系统性疾病。属于中医学“白疕”的范畴。清《医宗金鉴》指出白疕“固由风邪客皮肤，亦由血燥难荣外”。历代医家多从血论治银屑病，蜀中中医外科名家吴军教授认为本病病机为素体阳热偏盛，外受风湿热邪侵袭，内外邪气搏结于血分，至血热风燥，肌肤失养而成白疕。治疗以清热凉血、除湿解毒、祛风润燥为主。
　　加味净屑饮是在吴军老师净屑饮基础上加减化裁而成，方中水牛角粉清热解毒，凉血散瘀;玄参清热凉血，滋阴解毒共为君药;生地清热凉血，滋阴解毒;紫草凉血活血，解毒生肌;漏芦根清热解毒散结，共为臣药。白鲜皮清热燥湿，祛风解毒;昆明山海棠祛风除湿，活血止血;茜草根凉血止血，疏风通络;苦参清热燥湿，凉血解毒;威灵仙祛风湿;苍术祛风解表，健脾燥湿;板蓝根清热解毒，凉血利咽，上药共为佐药;鸡血藤行血补血，舒筋活络，能“治风毒通血脉”，为使药。全方共奏清热凉血、除湿解毒、祛风润燥之功。
　　银屑病发病机制复杂，目前研究认为免疫紊乱是银屑病发病机制的重要环节，也是当前研究的热点。最新的研究表明IL-23/Th17免疫调节通路在银屑病的发病机制中发挥关键作用[5]。Th17细胞及下游细胞因子IL-17A、IL-17F、IL-22等导致银屑病的炎症反应而至发病。咪喹莫特诱导银屑病样小鼠模型皮损特点、病理学特征及细胞因子改变都与银屑病相似，与银屑病进行期病理变化基本一致，基本符合中医银屑病血热证表现[6]。故本研究选用了咪喹莫特诱导BALB /c雌性小鼠作为银屑病模型。前期研究发现加味净屑饮显著降低银屑病患者PASI评分和DLQI评分，显示出较好的临床疗效。本次研究通过构建咪喹莫特诱导的银屑病模型小鼠，进一步观察加味净屑饮干预银屑病小鼠模型的组织病理改变和对Th17细胞相关细胞因子的影响，结果显示，加味净屑饮高剂量药物干预显著降低咪喹莫特诱导的模型小鼠左耳厚度，减少左耳炎症细胞的浸润，下调咪喹莫特诱导的模型小鼠血清Th17细胞细胞因子（IL-17）的表達水平。初步结果显示，加味净屑饮可能通过抑制IL-17产生水平介导治疗银屑病，然而具体作用机制需要进一步深入研究。
　　参考文献
　　[1]中华医学会皮肤性病学分会银屑病专业委员会.中国银屑病诊疗指南（2018简版）[J].中华皮肤科杂志，2019，52（4）：223-230.
　　[2]NESTLE F O，KAPLAN D H，BARKER J.Psoriasis[J].NEnglJ Med，2009，36（5）：496-509.
　　[3]MOOS S，MOHEBIANY A N，WAISMAN A，et al.Imiquimod-inducedpsoriasis in mice depends on the IL-17 signaling of keratinocytes[J].J Invest Dermatol，2019，139（5）：1110-1117.
　　[4]杨登科，郭奕妤，吴军，等.加味净屑饮治疗血热证寻常型银屑病60例疗效观察[J].皮肤病与性病，2019，41（5）：631-633.
　　[5]GANGULY D，HAAK S，SISIMK V，et al.The role of dendritic cells in autoimmunity[J].Nat Rev Immunol，2013，13（8）：566-577.
　　[6]李锘，押丽静，王磊，等.清热凉血方对IMQ诱导银屑病小鼠模型IL-17A、IL-10的影响及miR-210激动剂的干预作用[J].中国皮肤性病学杂志，2019，33（8）：885-889.
　　（收稿日期：2019-12-26 编辑：陶希睿）
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