3种中草药对克氏原螯虾肝胰腺抗氧化系统及组织结构的影响

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　　摘要：以平均体质量为（6.45±0.14） g克氏原螯虾为研究对象，分别投喂含1%姜黄素、肝胆利康散、穿梅三黄散的配合饲料，饲养42 d后检测并比较不同中草药对克氏原螯虾肝胰腺抗氧化应激指标和组织结构的影响。结果表明，3种中草药均显著提高了克氏原螯虾肝胰腺SOD和CAT活性，其中姜黄素对CAT活性的促进作用更显著;3种中草药均明显降低了肝胰腺的MDA含量，但对GSH-Px活性无显著影响。组织学观察发现3种中草药对克氏原螯虾肝胰腺未造成明显损失。由此可见，饲料中添加1%剂量的3种中草药可明显增强克氏原螯虾肝胰腺的抗氧化能力，且安全可靠。
　　关键词：克氏原螯虾;肝胰腺;抗氧化;组织结构;中草药
　　中图分类号： S942.1;S942.2+6
　　文献标志码： A
　　文章编号：1002-1302（2020）02-0183-05
　　收稿日期：2018-10-31
　　作者简介：邓 平（1979—），女，湖北枝江人，博士，工程师，主要从事水产养殖生态学研究。E-mail：sssdp@126.com。
　　通信作者：张立强，博士，高级工程师，主要从事鱼类病害研究。E-mail：280585404@qq.com。
　　克氏原螯虾（Procambarus clarkii），俗称小龙虾，是中国淡水虾类中的重要资源[1]。其肉味鲜美、营养丰富，深受广大消费者喜爱，成为国内广泛养殖的一种重要经济水生动物[2]。随着克氏原螯虾集约化养殖规模的扩大，病害问题日趋严重[3]，而抗生素等化学药物的滥用不仅会造成致病菌多重抗药性，还会引发药物残留等问题，危害环境和食品安全。因此，寻求绿色环保、安全高效的免疫强剂对克氏原螯虾养殖产业的可持续发展具有重要意义。
　　目前，有关中草药促进甲壳动物非特异免疫功能的报道已见于克氏原螯虾[4]、凡纳滨对虾[5-6]、罗氏沼虾[7]、斑节对虾[8]、中华绒螯蟹[9]等。姜黄素、肝胆利康散和穿梅三黄散具有保肝护肝作用，姜黄素和肝胆利康散还能提高水产养殖动物肝胰脏的抗氧化能力[10-12]，而3种中草药对克氏原螯虾的肝胰腺是否具有保护作用还未见报道。本试验通过连续投喂3种中草药制剂姜黄素、肝胆利康散、穿梅三黄散42 d，研究克氏原螯虾肝胰腺抗氧化应激指标[包括超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性、丙二醛（MDA）含量]的变化及对肝胰腺组织结构的影响，探讨中草药的作用机理，为中草药在克氏原螯虾饲料中的合理应用提供科学依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验饲料的制备本试验选取姜黄素、肝胆利康散（武汉中博水产生物技术有限公司提供成品，主要有茵陈、大黄、郁金、连翘、柴胡）、穿梅三黄散（武汉中博水产生物技术有限公司提供成品，主要有大黄、黄芩、黄柏、穿心莲、乌梅）为试验原料，按1%比例加入饲料，搅拌加水混匀，4 ℃冰箱保存备用。饲料的主要营养成分包括粗蛋白28.0%、粗脂肪4.0%、粗纤维10.0%、粗灰分12.0%、水分13.0%、钙0.6%、磷0.9%。
　　1.2 试验虾的饲养与管理
　　试验虾取自武汉市农业科学院水产研究所山坡基地养殖场，在武汉中博水产生物技术有限公司养鱼房进行试验。将克氏原螯虾暂养7 d后，分成对照组和3个试验组（姜黄素、肝胆利康散、穿梅三黄散），每组设置3个平行，每组投放10尾克氏原螯虾，养殖在50 L水族箱中。水族箱底放置PVC管，供克氏原螯虾蜕皮隐蔽用。每天投喂虾饲料1次，投喂量为虾体质量的3%～5%，次日投喂饲料前采用虹吸管吸出残饵与粪便并换水1/3，以保证水质清洁。试验周期为6周。
　　1.3 肝胰腺免疫酶学指标的测定及切片
　　分别于养殖42 d后从每个平行组随机取5尾活体进行解剖，剖取的肝胰腺组织用生理盐水漂洗后，一部分置于 -20 ℃ 冰箱冷冻保存，肝胰腺中SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA、总蛋白（TP）含量均采用相应的试剂盒检测。
　　另取一部分肝胰腺组织用4%中性甲醛固定，经洗涤、脱水、透明、渗透和包埋后，切成厚度为 5 μm 的薄片，HE染色，再经脱水和透明后用中性树胶封片，光镜下观察组织学特征。
　　1.4 统计分析
　　不同中草药对克氏原螯虾胰腺免疫酶学指标的影响采用单因素方差分析（A-NOVA）进行分析（SPSS 19.0，P<0.05）。
　　2 结果与分析
　　2.1 3种中草药制剂对肝胰腺抗氧化指标的影响由3种中草药对克氏原螯虾肝胰腺SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量的影响（图1）可知，与对照组相比，养殖42 d各添加组均能显著提高克氏原螯虾肝胰腺SOD活性（P<0.05），但各添加组间无显著性差异（P>0.05）。各添加组克氏原螯虾肝胰腺CAT活性均较对照组高（P<0.05），且各添加组间差异显著（P<0.05），姜黄素组克氏原螯虾肝胰腺CAT活性最高。各添加组克氏原螯虾肝胰腺的GSH-Px活性与对照组之间无明显差异（P>0.05）。与对照组相比，3种中草药均能显著降低克氏原螯虾肝胰腺MDA含量（P<0.05），但各添加组间无显著性差异（P>0.05）。
　　2.2 3种中草药制剂对肝胰腺组织结构的影响
　　连续投喂中草药42 d后解剖克氏原螯虾的肝胰腺进行HE染色，结果如图2所示。与没有投喂中草药的空白对照组相比，中草药各组的肝胰腺结构基本无损，肝小体排列整齐，基膜完整，肝小管呈星形，肝小体细胞排列紧凑无散落;肝小体间隙的血细胞无明显变化（100×）。空白组和3种中草药组肝小體细胞层的分泌细胞（B细胞）和吸收细胞（R细胞）均完整，R细胞无明显增多，部分B细胞体积有一定的增大（400×）。组织学观察发现，克氏原螯虾用1%剂量的中草药是安全的，对肝胰腺组织结构不会产生明显损伤。 　　3 討论与结论
　　3.1 3种中草药制剂对肝胰腺抗氧化指标的影响
　　肝胰腺是甲壳动物最主要的免疫器官，其SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量等与多种生理代谢和免疫反应有关，能综合反映甲壳动物的抗氧化防御系统功能[13-14]。
　　SOD和CAT是生物体内抗氧化防御功能的关键酶，它们能有效地清除活性氧自由基，减少脂质过氧化损伤。关于姜黄素提高水产养殖动物肝胰脏抗氧化能力已有较多报道，张滕闲等以姜黄素投喂黄颡鱼，肝胰脏SOD和CAT活性均显著提高[15];余少梅等用姜黄素投喂肝损伤的草鱼，能明显增强草鱼肝脏的SOD和CAT活性[12]。肝胆利康散对水产养殖动物脂肪肝有治疗作用[11]，也有关于提高肝损伤草鱼肝脏SOD和CAT活性的报道[12]。穿梅三黄散具有杀菌和辅助肝损伤修复的作用，其主要成分大黄、黄芪等，能明显促进罗氏沼虾、凡纳滨对虾和克氏原螯虾肝胰腺的SOD和CAT活性[14，16-17]，而复方中草药制剂穿梅三黄散对水产养殖动物非特异性免疫方面的研究还未见报道。本试验中分别以1%姜黄素、肝胆利康散、穿梅三黄散饲养克氏原螯虾42 d，其肝胰腺SOD和CAT活性均明显升高，其中3种中草药添加组SOD活性差异不显著，而3种中草药对CAT活性影响差异显著，以姜黄素对CAT活性促进作用更明显。该结果表明，3种中草药对克氏原螯虾抗氧化系统的SOD与CAT协同发挥作用，而姜黄素作用于CAT的效果更强。
　　GSH-Px能帮助机体保持正常的免疫系统功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用。3种中草药（或主要成分）对水产养殖动物GSH-Px活性的影响不尽相同，姜黄素可显著提高肝损伤草鱼、黄颡鱼和奥尼罗非鱼肝胰脏的GSH-Px活性，但降低了大菱鲆幼鱼血清中的GSH-Px活性[12，15，18-19]。肝胆利康散提高了肝损伤草鱼肝脏的GSH-Px活性[12]。大黄素可明显提高克氏原螯虾肝胰腺 GSH-Px 活性[17]。本试验中3种中草药对克氏原螯虾肝胰腺GSH-Px活性无显著激活作用，可能与3种中草药对克氏原螯虾抗氧化酶的促进作用和酶的种类有关。
　　MDA是最重要的脂质过氧化产物，它的含量反映了细胞受损伤的程度和脂质过氧化程度，从而间接反映体内活性氧的积累情况[20]。本研究中3种中草药添加组克氏原螯虾肝胰腺的MDA含量明显降低，说明饲喂3种中草药的克氏原螯虾机体抗氧化系统在此时能够对生成的氧自由基进行及时清除，脂质过氧化反应的水平较低。这与3种中草药（或主要成分）对草鱼、凡纳滨对虾及克氏原螯虾等水产养殖动物的研究结果[12，16-17]一致。
　　3.2 3种中草药制剂对肝胰腺组织结构的影响
　　克氏原螯虾肝胰腺和其他甲壳动物一样，肝小体是其结构和功能的基本单位[21]。肝小体主要由基膜、细胞层和肝小管组成，细胞层中的细胞可分为分泌细胞（B细胞）、存储细胞（R细胞）、纤维细胞（F细胞）和胚细胞（E细胞），其中B细胞和R细胞数量较多[22]。在本试验采样过程中发现，投喂中草药的克氏原螯虾肝胰腺色泽红润。肝胰腺组织切片HE染色后，投喂姜黄素、肝胆利康散、穿梅三黄散的克氏原螯虾肝胰腺组织结构无显著病理变化。卢婉怡也有研究表明，灌喂高剂量的姜黄素未引起奥利罗非鱼肝胰腺的病理变化[19]。姜黄素和肝胆利康散还可改善肝损伤草鱼肝组织的病理变化[12]，而连续投喂含乌梅的复方中草药对凡纳滨对虾的肝胰腺没有产生损害[23]。这说明本试验所用的3种中草药对克氏原螯虾肝胰腺组织不会产生明显损伤。
　　综上所述，在饲料中投喂3种中草药均增强了克氏原螯虾肝胰腺抗氧化功能，并且对机体没有损伤，因此具有良好的应用前景。
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