植物组织培养中常见污染类型及防控技术探讨
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作者:刘文静
摘 要 在植物组织培养过程中，污染问题的存在会对培养材料的生长发育产生严重影响，并造成不同程度的科研、生产损失。基于此，对植物组织培养期间常见的污染类型进行分析研究，并提出科学的防控技术。
关键词 常见污染类型;植物;组织培养;污染防控
中图分类号：S359 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.36.061
植物组织培养，是指借助细胞全能性特点，在人工配置培养基中采取无菌操作对植物的外植体进行接种，然后利用人工控制的方式模拟植物生长环境，以此实现离体培养的一种方法与技术。随着植物组织培养科研力度的不断加大，现阶段遗传改良、种质保存以及植物快繁等领域都涉及到对植物组织培养的应用。而当前植物组织培养的开展，虽然在培养环境、培养操作等方面均按照无菌要求标准开展，但是植物组织污染现象时有发生，不仅影响到实验成本和效果，甚至对大规模生产造成影响。因此，进行植物组织培养的深入研究分析，具有重要的现实意义。
1 植物组织培养常见污染类型
植物组织培养污染是指植物组织培养过程中因培养材料因素或外界微生物的侵染，使得植物组织和培养基滋生杂菌，导致培养实验最终以失败而告终。当前植物组织培养中的常见污染具体分为病毒、真菌以及细菌污染。
1.1 细菌污染
作为庞大数量的微生物群，细菌充斥在我们的生活环境中，空气、泥土、水源中都分布着大量的细菌，且不同细菌的大小、形态存在一定差异。植物组织培养期间出现细菌污染，主要表现为植物材料表面或者是培养基表面产生黏液状物体或浑浊水迹状，有时会呈现出泡沫发酵状。通常情况下，植物材料在接种后1～2 d就能发现细菌污染[1]。细菌污染的主要产生因素在于实验人员接种期间对接种材料以及接种工具使用不当，其中，芽孢杆菌与葡萄球菌是常见的细菌污染种类。
1.2 真菌污染
真菌喜好潮湿、温度高的环境，若植物组织培养期间出现真菌污染，主要表现为出现毛绒状、絮状菌斑，并产生不同颜色孢子。真菌污染多在植物材料接种2～3 d可以发现，会形成较大面积的菌落，产生多颜色的绒毛状菌斑，并且会散发出霉味。真菌污染的产生因素在于接种期间的环境问题，常见真菌污染种类包括青霉菌、黑曲霉菌、芽枝霉菌、酵母菌等[2]。
1.3 病毒污染
病毒常以颗粒形式存在，体积非常小，并且病毒污染的概率也相对较小。在植物组织培养过程中，病毒的污染仅凭肉眼观察是难以发现的，需要借助电子显微镜来具体观察[3]。病毒多在细胞内潜伏，并且不会导致整个细胞坏死。植物组织培养期间产生病毒污染的主要因素是外植体。
2 植物组织培养常见污染防控技术
2.1 外植体污染消除
2.1.1 科学合理采集选择外植体
要想避免因外植体对植物组织培养造成污染，需从源头处进行污染防控，所以应注重对外植体的科学采集与选择。在不同环境下，外植体携带细菌的程度存在一定差异，一般针对脱毒植物应采用分生组织进行培养，以降低污染发生率[4]。而对于采集时间的控制，应尽可能在春季采集外植体，并在晴天中午开展采集作业。当然，外植体采集环境最好选择在室内，或者是采集新生嫩芽，因为春季污染程度相对较低，而且晴天环境污染程度小于下雨天，室内植物携带的细菌少于室外植株。此外，需注意采集前必须用75%酒精对工具、用具以及人员手部进行消毒，降低污染发生率。
2.1.2 科学预培养外植体
若外植体采集为室外采集，并检测出外植体污染严重，则可以利用室内盆栽的方式来降低污染程度，可采用珍珠岩、蛭石种植，并结合施加抗生素来降低污染程度[5]。需要注意，应控制外植体生长，禁止在室内盆栽中施加肥料，合理控制外植体生长温度、湿度以及光照。等到外植体抽出新芽后，结合细菌病毒检测结果选择是否将其新芽当作外植体。若植株无法进行室内盆栽，则可以利用塑料袋覆盖，等到植株抽出新芽后，选择合适外植体。
2.1.3 细致清洁、消毒外植体
等到外植体确定完毕，应开展高效的外植体清洁消毒工作，在尽可能减少对外植体伤害的基础上，确保其携带的微生物被彻底消毒灭杀。在具体清洁消毒过程中，先将外植体表面的泥土污垢用清水冲洗掉，然后进行剪枝，接着将外植体放入烧杯中用洗洁精水浸泡
3 min，之后将其放置于流水状态下冲洗30 min，最后在无菌操作台中用75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗后再用0.1%升汞浸泡10～30 min。需要注意，在清洁消毒期间应合理应用与选择消毒剂，避免消毒剂对外植体产生毒害作用[6]。
2.2 环境污染防控
2.2.1 熏蒸消毒技术
在开展植物组织培养前，应结合具体情况开展熏蒸处理，合理配置熏蒸液，具体包括高锰酸钾3～6 g·m-3、甲醛4～6 mL·m-3。熏蒸前，应将实验室的门窗关闭，然后将事前调配好的甲醛溶液倒入高锰酸钾溶液中，此时因化学反应会产生大量烟雾，工作人员必须立即避开烟雾，避免对人体造成伤害。等到熏蒸时间达到30 min后，即可停止熏蒸。在植物组织培养期间应保持每月一次的频率开展熏蒸消毒。
2.2.2 紫外灯照射消毒技术
應及时清理污染培养基、污染物品，保持培养室中清洁干净，并且保持培养架干净且无杂物。与此同时，利用次氯酸钠消毒液对接种室和培养室进行定期消毒。每次接种前用75%酒精喷洒室内促使灰尘降落，然后用紫外灯照射30 min，以此起到消毒的作用。
2.2.3 设备消毒
针对接种室、培养室内工作人员每天接触的工具、用具必须提前进行消毒处理，而无菌操作台必须在使用前进行30 min的紫外灯照射，并且对操作台上各个操作面用75%酒精进行细致擦拭。操作台的过滤网需要每月一换，切不可在操作台中随意堆放物品。需要注意，若操作台长期未使用，必须在使用前彻底清洁消毒，并对操作台的灭菌效果进行检测。若灭菌效果不理想，会直接影响到培养结果，所以必须严格按照规定进行灭菌。 2.3 操作污染管理
2.3.1 人员卫生控制
植物组织培养操作人员应保持卫生，必须在工作期间定期修剪指甲并勤洗手。在无菌操作区域，禁止佩戴任何首饰，禁止吸烟、喝水、听音乐、进食。工作服仅能在无菌环境内穿着，禁止带出无菌室。定期进行更衣室的清洁消毒，工作服需保持至少每7 d 1次的清洁消毒次数。工作人员在进入无菌环境前，必须用肥皂或洗手液进行手部清洁，等到穿衣完毕后，再次用消毒液进行手部清洁，进而降低外植体受污染的概率[7]。
2.3.2 严格执行操作规程
在植物组织培养期间，操作不当也极易导致污染问题出现。所以，在具体操作期间，必须严格按照相关规定要求。1）配制室。培养基必须在培养作业开展的前2天配制完毕;要定期对天平、pH计、温度计进行检查;针对化学药品的保存，必须保持其存储环境温度在4 ℃;对高压灭菌锅等设备的使用，必须按照规定要求进行。2）培养室。培养室的光照、温度和湿度必须按照规定要求合理调整，并对室内温度、湿度、光照定时记录。若温度、湿度过高或过低，应及时采取合理措施进行调整，避免对外植体的生长造成影响。3）操作室。接种前，操作室必须用紫外灯照射30 min，并定期开展地面消毒工作，同时，工作人员需对操作台的清洁度进行定期检测，严格控制工具、用具的灭菌时间。
3 结语
随着我国科学技术的迅猛发展，植物组织培养技术的应用愈发广泛。而要想最大化实现植物组培技术的作用与价值，就需对当前植物组培常见污染进行深入分析，结合科学的污染防控技术来降低植物组织培养期间出现污染的概率。
参考文献：
[1] 任目瑾，周建峰.植物组织培养的常见污染及其防控技术[J].陕西林业科技，2016（6）：103-105.
[2] 彭立群，田子珩，张俊琦.植物组培中污染发生原因及防治技术研究进展[J].广东林业科技，2012，28（1）：82-86.
[3] 叶添谋.植物组织培养过程中的常见技术难题研究进展[J].韶关学院学报，2010，31（3）：84-90.
[4] 邵龙珠，赵淑君，王淑荣，等.植物组织培养中的常见问题与解决技术措施[J].林业勘查设计，2012（1）：49-51.
[5] 潘娟，李先源，李名杨.植物组织培养过程中常见问题及解决方法[J].安徽农业科学，2009，37（6）：2392-2394.
[6] 趙春莉，李金英.植物组织培养中污染原因及其控制方法[J].吉林农业科学，2010，35（6）：11-13.
[7] 周权男，姜泽海，李哲，等.植物组织培养中污染控制技术的研究现状[J].热带农业科学，2012，32（9）：53-56.
（责任编辑：赵中正）
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