内生木霉P3.9菌株在枇杷根际土壤中的定殖能力测定

来源:用户上传      作者:鲁海菊 谢欣悦 陶宏征 沈云玫 王栋

　　摘要： 采用土壤稀释分离法与平板计数法测定内生木霉P3.9菌株在枇杷根际土壤中的种群密度，跟踪测试90 d内其在枇杷根际土壤中的定殖动态，结果表明，P3.9菌株在枇杷根际土壤中的定殖过程大致可划分为3个阶段，前 25 d 内，菌株相对含量以10 d为1个周期呈增减增减变化趋势，且于10 d时达到最大值，为9.52×105 CFU/g，该时期木霉P3.9菌株在根际土壤中快速适应并定殖存活;25～65 d期间，P3.9菌株相对含量的变化周期延长至20 d，也呈增减增减变化趋势，且波动幅度较5～25 d期间小，该时期木霉能够相对稳定地定殖存活于根际土壤中;65～90 d期间，P3.9 菌株相对含量在65～75 d期间出现小幅度增加后呈近直线状下降态势;5～75 d期间，P3.9菌株相对含量维持在105 CFU/g水平上，且75 d时较接种量只下降1个数量级，說明木霉P3.9菌株在枇杷根际土壤中的持效期可达75 d。
　　关键词： 生防菌;内生木霉;定殖能力;根际土壤;枇杷;种群密度法;持效期
　　中图分类号： S436.67+9;S182  文献标志码： A
　　文章编号：1002-1302（2020）05-0263-05
　　 近代以来，随着化学农药的广泛使用，化学农药对生态环境、食品安全、人体健康等方面的负面影响越发引起人们的重视，而有关生防菌的研发与应用也逐渐成为关注的热点。目前，在所有生防菌制剂中，木霉属（Trichoderma）真菌制剂产品约占60%[1]。木霉属真菌在自然界中分布广泛，是土壤微生物群落结构的重要组成部分，其菌丝生长与孢子萌发对温度、湿度、pH值等适应范围广，且腐生能力强，生长繁殖速度快，可迅速利用营养、占据空间[2-3]，能防治多种植物的土传病害。自1932年Weindling发现木霉以来[4]，人们对其开展了大量研究，并分离得到多种木霉，而在众多种类中，绿色木霉、哈茨木霉对植物病害表现出较好的防治效果[5]。
　　木霉菌的成功定殖是其发挥防治作用的基本前提，且防治效果也部分取决于其存活定殖能力[6]。有关木霉在土壤中定殖能力的研究已有相关报道，杜婵娟等结合时间因子，探究了木霉在土壤空间的定殖规律[7];肖荣凤等跟踪分析了对茄科尖孢镰刀菌有拮抗作用的哈茨木霉在土壤中的存活与定殖能力[8];古丽君等明确了施用于草坪土壤的木霉在较短时期内的定殖特性[9]。
　　木霉P3.9菌株对枇杷根腐病菌具有极强的抑菌及重寄生作用，抗菌谱广[10]，且固体发酵条件简单[11]，对部分化学农药具有耐药性[12]，能定殖于枇杷各个器官及其根际土壤[13]。为进一步明确木霉P3.9菌株在枇杷根际土壤中的施用持效期及最佳施用时期，本研究采用土壤稀释分离法与平板计数法，跟踪分析该菌株随时间延长在土壤中的定殖动态，以期为该菌株的进一步开发利用提供理论依据和技术支持。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 供试材料 内生木霉（Trichoderma atroviride）P3.9菌株，分离自枇杷主干韧皮部，保存于红河学院生命科学与技术学院植物病理学标本室。1年生枇杷嫁接苗，种植于直径为23 cm、深为18 cm的营养袋中。
　　1.1.2 供试培养基 PDA培养基：马铃薯200 g、琼脂粉20 g、葡萄糖16 g。木霉选择性培养基：MgSO4·7H2O 0.2 g，KCl 0.15 g，K2HPO4 0.9 g，（NH4）2SO4 1.0 g，葡萄糖3.0 g，玫瑰红[四氯四碘萤素钠盐（C20H2O5Cl4I4Na2）]0.033 g，琼脂粉20 g，75%五氯硝基苯可湿性粉剂0.2 g，蒸馏水 1 000 mL，所用试剂为分析纯。配制好的培养基在 121 ℃ 下高压灭菌 30 min，备用。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 木霉菌悬液的准备与根际土壤接种 将试管斜面保存的P3.9菌株移入PDA平板上活化，待菌落长满培养皿时，用打孔器取直径为5 mm的菌饼，接入新的PDA平板中央进行培养，共培养5皿，28 ℃下培养5～7 d;待菌落长满全皿，收集所有培养物至粉碎机中，加入适量无菌水，充分打匀，制成菌悬液，使孢子浓度为1×106 CFU/mL，备用;将孢子悬浮液浇灌于枇杷嫁接苗根际，500 mL/株，以浇灌等量清水作为对照。重复10次，常规肥水管理。
　　1.2.2 木霉定殖能力的测定 自浇灌木霉孢子悬浮液起90 d内，每隔5 d用高为0.5 m、钻头直径为38 mm的不锈钢环刀土钻在枇杷嫁接苗根际取土样1次，采集深度为5～15 cm，每处理随机取5株，每株采用5点取样法采集土样，并采用四分法充分混匀土样，备用;称取1 g土样置于装有99 mL无菌水的三角瓶中，在转速为200 r/min的振荡仪器上振荡20 min，配制成10-2土壤稀释悬浮液;静置2 min后，用无菌微量移液器吸取悬浮液1 mL，加入到 9 mL 无菌水中混匀，即为10-3土壤稀释悬浮液，如此重复，依次配制成10-4、10-5土壤稀释悬浮液;取10-5土壤稀释悬浮液50 μL，采用倾注法加入木霉选择性平板培养基中，在28 ℃恒温培养箱中培养 3～5 d，统计平板上直径≥10 mm、近圆形、扁平、呈放射状的无色透明或浅绿色单菌落数量，重复5次;计算土样中木霉种群密度，计算公式为
　　种群密度=每皿菌落平均值×稀释倍数×20×水分系数;
　　环比增长率=（本期的木霉种群密度-上一期木霉种群密度）/上一期木霉种群密度×100%;
　　同比增长率=（本阶段木霉种群密度变化值-上一相同变化阶段木霉种群密度变化值）/上一相同变化阶段木霉种群密度变化值×100%。
　　其中，环比增长率、同比增长率为正值时表示增长，为负值时表示下降。 　　1.3 数据统计
　　采用Excel 2010软件对试验数据进行汇总计算、作图，采用SPSS 19.0软件进行统计分析，采用Duncans新复极差法进行差异显著性检验。
　　2 结果与分析
　　2.1 木霉P3.9菌株施入枇杷根际土壤5～90 d期间的定殖动态
　　由图1可见，P3.9菌株在枇杷根际土壤中的定殖过程大致可划分为3个阶段，第1阶段为前25 d内，菌株相对含量以10 d为1周期呈“增减增减”变化趋势，且于10 d时达到最大值，为9.52×105 CFU/g，该时期木霉P3.9菌株在根际土壤中快速适应并定殖存活;第2阶段为25～65 d期间，P3.9菌株相对含量的变化周期延长至20 d，也呈“增减增减”变化趋势，且波动幅度较5～25 d期间小，该时期木霉能够相对稳定地定殖存活于根际土壤中;第3阶段为65～90 d期间，P3.9菌株相对含量在施入土壤65～75 d期间出现小幅度增加后呈近直线状下降态势，75 d时木霉相对含量为1.11×105 CFU/g，较接入的初始木霉数量下降1个数量级，而至90 d时木霉相对数量达到最低值，为4×103 CFU/g。
　　2.2 木霉P3.9菌株施入枇杷根际土壤3个阶段的定殖动态分析
　　2.2.1 第1阶段 由表1、图2、图3可见，在5～25 d 期间，枇杷根际土壤施入木霉P3.9菌株的处理，木霉相对含量（孢子数量）以10 d为1周期呈“增减增减”波动变化，且总体减少趋势，木霉施入土壤后前期相对含量迅速上升，10 d时达到最大值，此时木霉相对含量为9.52×105 CFU/g，较接种5 d时环比增长575.18%，随后出现下降趋势，接种处理 15 d 时木霉相对含量较10 d时环比下降70.27%，之后又上升，接种处理20 d时菌体相对含量较15 d时环比上升116.96%，之后又下降，接种25 d时较接种20 d时环比下降76.71%;接种处理5～25 d内，每隔5 d测得的木霉相对含量相互间差异极显著（P<0.01），且10～25 d测得的木霉相对含量均高于最初检测值，表明该测试菌株施入土壤后前期定殖能力较强;木霉在枇杷根际土壤中的定殖共历经2个周期（5～15 d、15～25 d），第2个周期的波动幅度低于第1个周期， 第2个周期增长阶段较第1个周期增长阶段同比下降59.19%。未接种的对照组没有观察到木霉菌落的出现。
　　2.2.2 第2阶段 由表2、图4、图5可见，在25～65 d期间，每隔5 d测得的土壤中木霉相对含量相互间存在极显著差异（P<0.01）;未接种木霉的对照组分别于30、50、60 d观察到极少量木霉，其他调查时间未观察到木霉菌落的出现。该阶段，木霉相对含量变化同样历经2个周期（25～45 d、45～65 d），时间间隔延长为20 d，木霉相对含量分别于25～35 d、45～55 d呈上升趋势，35～45 d、55～65 d呈下降态势，在第1个周期内，接种处理 35 d 时的菌体相对含量较25 d时环比上升 93.01%，45 d时的菌体相对含量較35 d时环比下降67.03%;在第2个周期内，接种处理55 d时的菌体相对含量较 45 d 时环比上升205.49%，65 d时的菌体相对含量较55 d时环比下降67.27%;第2个周期增长阶段较第1个周期增长阶段同比上升40.60%，而下降阶段同比上升1.08%，2个周期的波动幅度相似且最值接近，说明该阶段测试菌株定殖存活能力的动态变化趋于相对稳定状态。
　　2.2.3 第3阶段 由表3、图6可见，在65～90 d期间，随调查时间的延长，接种处理的木霉相对含量呈先增后减的变化趋势，没有明显的周期性变化规律，且菌株的定殖存活能力已处于整体测试阶段的最低水平，而未接种木霉的对照组分别于70、75 d时观测到有少量木霉出现，而其他调查时间均未发现;接种处理70 d时的木霉相对含量达到本阶段最大值，为1.45×105 CFU/g，较65 d时环比上升59.34%，而75 d时的木霉相对含量较 70 d 时环比下降23.45%;接种处理75 d后菌体相对含量呈近直线下降趋势，90 d时达到最低值，仅为4.00×103 CFU/g，此时若无外力干预，该菌株在施用土壤中可能无法继续存活并发挥生防作用。
　　3 结论与讨论
　　有研究表明，生防菌的快速定殖能力是提高其对土传病害防治效果的重要因素之一[14]。许传坤等研究表明，木霉的萌发会受到土壤抑真菌作用的抑制[15]。贺字典等研究发现，某些木霉在施入土壤后会历经一个适应过程，一旦适应后其定殖数量会迅速上升[16]。康萍芝等发现，在施入土壤的较短时期内，木霉数量会迅速到达峰值，之后随着时间延长而逐渐呈下降趋势[17]。本研究发现，木霉P3.9菌株在施入土壤的最初10 d内，相对含量呈指数形增长，接种10 d时达到最大值，随后开始回落，并以 10 d 为1个周期呈“增减增减”变化趋势，且增减幅度相对较大，而自接种处理25 d开始，呈以20 d为周期的“增减增减”变化趋势，增减幅度减小，说明木霉P3.9菌株在历经较短适应期后快速定殖于施用土壤中。
　　古丽君等研究发现，深绿木霉接种于土壤后，前期存在大量孢子，随着调查时间的延长，孢子数量呈先逐渐下降、再略有上升、后保持相对稳定的变化趋势，稳定时木霉在土壤中的相对含量为 104 CFU/g[9]。徐瑞富等研究发现，木霉在未灭菌耕作层、亚表层中的定殖变化趋势呈先增后减、波浪状生长曲线[18]。Orr等研究表明，将1株木霉菌株存放在持续保湿的环境中，3 d后菌落数量变化与时间的增加呈正相关关系，保存时间延长到5 d后，随保存环境的改变，菌株含量呈下降趋势[19]。本研究结果表明，内生木霉P3.9菌株接种处理75 d时的相对含量虽较接入时的初始菌量下降近1个数量级，但土壤中该菌体相对含量仍能稳定在 105 CFU/g，说明木霉P3.9菌株相对含量相对稳定，持续期约为75 d，优于古丽君等研究报道的菌株[9，20]，这可为其进一步开发利用提供一定的理论依据。 　　参考文献：
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　　收 稿日期：2019-02-15
　　基金项目：国家自然科学基金（编号：31660147）;云南省应用基础研究计划（编号：2016FB066）;红河学院应用型科学研究重点项目（编号：XJY15Z06）。
　　作者简介：鲁海菊（1978—），女，云南大理人，博士，教授，从事植物病理学研究。E-mail：luhaiju2011@126.com。
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