莲藕棒孢霉叶斑病病原鉴定及其生物学特性测定

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　　摘  要  对海南省海口市桂林洋莲藕田的莲藕植株上发生的一种新病害莲藕棒孢霉叶斑病的病原进行了鉴定，并对病原菌进行了生物学特性测定。研究结果表明：该病原菌为山扁豆生棒孢[Corynespora cassiicola （Berk.& Curst.） Wei];病原菌菌丝生长的适宜条件为温度25～30 ℃，pH 6～9，碳源为无水葡萄糖或D-木糖，氮源为牛肉膏或大豆蛋白胨;最适生长条件为温度28 ℃，pH 7，碳源为无水葡萄糖，氮源为牛肉膏。光照对该病原菌的影响不大。
　　关键词  莲藕;叶斑病;山扁豆生棒孢;生物学特性中图分类号  S436.45      文献标识码  A
　　Abstract  In order to identify the pathogen of leaf spot disease on Nelumbo nucifera Gaertn. and to study the biological characteristics， the samples of Corynespora leaf spot on lotus roots were collected from a lotus root field in Haikou， Hainan. The results showed that the pathogen was Corynespora cassiicola （Berk.& Curst.） Wei， the optimum temperature for mycelial growth was 25?30 ℃， and 28 ℃ was the most suitable temperature. The suitable pH was 6-9 and the best pH was 7. The mycelium of C. cassiicola grew well on the medium with anhydrous dextrose and D-xylose as the carbon sources. Peptone and beef extract was the best nitrogen source. Light had little effect on the pathogen.
　　Keywords  Nelumbo nucifera; leaf spot disease; Corynespora cassiicola; biological characteristic
　　DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.017
　　莲藕（Nelumbo nucifera Gaertn.）属睡莲科（Nymphaeaceae）莲属（Nelumbo Adans.）的一種重要水生植物，在我国已有3000多年的种植历史，药食兼用，具较高经济价值和观赏价值[1]。目前，随着莲藕连年的大面积种植，一些叶部病害已发展为莲藕生产中的主要病害，其中莲藕褐斑病（Pseudocercospora nympnaeacea）在湖北武汉和孝感、江西上饶和安福等地区严重发生，病株率一般为10%～50%，最高达80%以上[2-5]。海南省是莲藕主要的种植区之一，2015年12月，在海南省海口市桂林洋农场莲藕种植基地发现一种新的莲藕叶斑病，由棒孢属真菌引起，取名为莲藕棒孢霉叶斑病，该病在田间发病极为严重，病株率达50%～90%，重病田高达100%。
　　国内已报道的莲藕叶部病害有睡莲假尾孢菌（Pseudocercospora nymphaeacea）引起的褐斑病、链格孢属（Alternaria sp.）真菌引起的叶斑病、喜湿叶点霉菌（Phyllosticta hydrophila）引起的叶点霉叶斑病、壳二孢菌（Ascochyta sp.）引起的盘单毛孢斑枯病、喜水小菌核菌（Scle ro tium hydrophilum）引起的小核菌叶腐病、由胶孢炭疽（Colletotrichum gloeosporioides）引起的莲藕炭疽病等[6]。2017年陈雯等[7]研究报道江苏的莲藕褐斑病的病原菌为山扁豆生棒孢（Cory nes pora cassiicola），但仅对此病的症状及发生情况进行了简述。本研究旨在鉴定明确海南莲藕棒孢霉叶斑病的病原菌种类并研究其生物学特性，以期为防治莲藕棒孢霉叶斑病和进一步深入研究提供参考。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　1.1.1  样本采集  莲藕棒孢霉叶斑病的样本采自海南省海口市桂林洋发病的莲藕田。
　　1.1.2  供试培养基、试剂和设备  供试培养基：PDA培养基参阅《植病研究方法》[8]配制，Czapek培养基参阅《植物病理学实验技术》[9]配制。所用试剂为DNA片段回收试剂盒、Taq酶和DNA Marker，分别购自美国OMEGA公司、北京Biomed公司、大连TaKaRa公司。设备为日本Olympus BX41显微镜和上海京工JY600电泳仪。
　　1.1.3  供试植物品种  海南大学学生教学实践基地内种植的莲藕、橡胶树、木薯、番木瓜、茄子等植株。
　　1.2  方法
　　1.2.1  病原分离  采用组织分离法从发病的莲藕病叶上分离纯化病原菌：将采集的新鲜莲藕病叶洗净晾干，在超净工作台上从病叶的病健交界处剪取0.8 cm×0.8 cm大小的组织块，先用70%酒精消毒10 s，再用0.1%升汞消毒1 min，然后用无菌水洗涤3次（每次1 min），最后将消毒好的组织块放入PDA平板中培养3 d，挑取菌落进行纯化，待产孢后进行单孢分离纯化，从多个菌株中选择一株生长良好的菌株，编号为LOBB001备用。 　　1.2.2  致病性测  采用菌丝块接种法测定LOBB001菌株的致病性。培育5株健康莲藕植株，先将健康莲藕已展开的嫩叶用75%酒精进行喷雾消毒，然后用无菌束针轻轻刺破接种点表皮，挑取病原菌菌丝块并将菌丝面朝下放置在针刺处，以同样大小的无菌PDA块为对照，覆盖湿棉花后套上塑料袋保湿，24 h后移去塑料袋，每24 h观察一次发病情况。发病后从病斑上重新分离病原菌，观察其分生孢子形状及菌落特征，并与接种菌株进行比较。采用相同的方法将病原菌接种橡胶树、番木瓜、茄子、木薯等小苗的成叶以评价病原菌侵染能力。
　　1.2.3  菌株鉴定  （1）形态学鉴定。在显微镜下观察并描述分离病原菌的菌落特征，待分离菌产孢后，观察病叶上的病原菌孢子，用显微镜对其进行拍照和测量。参考《植物病原真菌学》[10]进行形态鉴定。
　　（2）分子鉴定。使用OMEGA Fungal DNA Kit试剂盒提取供试真菌DNA。使用通用引物序列ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），以所提取供试真菌DNA为模板进行PCR扩增[11]。扩增产物纯化、回收后，送华大基因公司进行序列测定。将所获的序列在NCBI 进行Blast比对，并选取山扁豆生棒孢（Corynespora cassiicola）、凸脐蠕孢（Exserohilum turcicum）、灰梨孢（Pyricularia grisea）等8个近源物种的模式菌株序列，使用MEGA 6.0软件进行多序列比对，采用邻接法构建系统发育树。
　　1.2.4  莲藕棒孢霉叶斑病病原菌生物学特性测定
　　（1）不同温度对莲藕棒孢霉叶斑病病原菌菌落生长的影响。在超净工作台里用直径为0.5 mm的打孔器从纯化备用的LOBB001菌株菌落边缘打取菌丝块，然后将打好的菌丝块接种在PDA培养基平板中央，每个处理3次重复，分别置于相同条件下10、15、20、25、28、30、35 ℃的培养箱中进行恒温光暗交替培养，每天用十字交叉法测量1次菌落直径;连续测量9 d。
　　（2）不同pH对莲藕棒孢霉叶斑病病原菌菌丝生长的影响。PDA培养基冷却至50 ℃左右，利用1 mol/L HCl溶液或1 mol/L NaOH溶液调节PDA培养基pH至2、3、4、5、6、7、8、9、10和11制作平板培养基，用灭菌接种针挑取LOBB001菌株菌丝块并置于平板中央，每个处理设3次重复。在最适温度黑暗条件下进行培养，每天采用十字交叉法测量1次菌落直径;连续测量9 d。
　　（3）不同碳源、氮源对莲藕棒孢霉叶斑病病原菌菌落生长的影响。选Czapek培养基为基础培养基。分别用等质量的无水葡萄糖、麦芽糖、D-果糖、D-半乳糖、D-木糖、D-山梨醇、蔗糖、可溶性淀粉、α-乳糖、肌醇、甘露醇和甘油替代Czapek培养基中的蔗糖，配置成不同碳源的培养基，以不加碳源的Czapek培养基为空白对照。分别用等质量的硝酸钾、硝酸钠、硝酸钙、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、草酸铵、L-天冬酰胺、牛肉膏、大豆蛋白胨和酵母浸膏置换Czapek培养基中的KNO3，配置成不同氮源的培养基，不加氮源的Czapek培养基为空白对照。将直径5 mm的LOBB001菌株菌丝块（PDA培养基上培养9 d）接种在不同碳源、氮源的培养基平板中央，每种碳源、氮源分别重复3次，在28 ℃恒温培养箱培养9 d，每天采用十字交叉法测量1次菌落直径。
　　（4）不同光照对莲藕棒孢霉叶斑病病原菌菌落生长的影响。将LOBB001菌株5 mm的菌丝块接种在PDA培养基平板中央，在相同温度条件下分别置于完全光照、光暗交替（每12 h换1次）和完全黑暗，每种条件设3次重复，每天采用十字交叉法测量1次菌落直径，培养9 d。
　　1.3  数据处理
　　采用Excel 2007软件对所得数据进行整理，并用SAS 8.1软件进行差异显著性分析[12]。
　　2  结果与分析
　　2.1  莲藕棒孢霉叶斑病症状
　　莲藕棒孢霉叶斑病在田间发病较为严重（图1A），发病初期在叶片上出现圆形小黑点，小黑点边缘不整齐、外围具不明显黄晕圈，斑点大小约为1 mm，病斑逐渐沿小叶脉扩展（图1B）;随后病斑扩大并变黑褐色，边缘呈不规则形，边缘小叶脉变黑，呈放射状或沟壑状向四周扩展，病斑中央为1个灰白色小圆斑，边缘有较窄且明显的黄色晕圈。病斑背面灰褐色，叶正面黑褐色（图1C）;发病后期病斑变黄褐色，边缘黄色晕圈更加明显，潮湿条件下病斑背面长有灰褐色霉层，数个病斑扩展汇合后使叶片提早干枯（图1D）。
　　2.2  致病性测定
　　采用针刺法接种3 d后，接种LOBB001菌株菌丝块的莲藕叶片伤口变蓝黑色，具明显黄晕圈，与田间莲藕病叶所表现的症状相同;而接种PDA培养基的空白对照组则无明显变化（图2）。从发病部位取样进行再分离，获得与LOBB001菌株相同的分离物，表明LOBB001菌株为该病害的致病菌。
　　2.3  对其他植物的侵染性测定
　　在田间接种4种棒孢属真菌在海南侵染发病严重的植物小苗叶片，除番木瓜老叶不发病外，番木瓜嫩叶、橡胶树、茄子和木薯成叶均发病。表明莲藕棒孢霉叶斑病病菌人工接种可侵染番木瓜、橡胶树、茄子及木薯叶片，且容易侵染較嫩的叶片（图3）。
　　2.4  病原菌鉴定
　　2.4.1  形态学鉴定  LOBB001菌株在PDA培养基上生长的菌落正面呈灰绿色、绒状，具较宽的同心环带，边缘整齐（图4A）。菌落背面呈墨绿色。病叶上的分生孢子梗直或弯曲，不分支，单生或丛生，浅褐色至褐色，2～10个分隔，大小为（66.79～233.27）μm×（6.89～10.03）μm，平均为139.24 μm×8.57 μm，分生孢子基部略膨大，直径（11.07～20.81）μm，平均14.51 μm（图4B）。分生孢子在分生孢子梗顶端单生或串生，初生分生孢子圆柱形，无色至浅色，无隔，成熟分生孢子倒棍棒状，直或略弯，浅橄榄色或褐色。有4～18个假分隔，分隔处微缢缩或不缢缩，顶端钝圆，基部脐点平截，加厚明显，分生孢子大小（50.23～211.41）μm×（12.00～20.06）μm，平均为 　　2.4.2  分子鉴定  对病原菌进行ITS-PCR扩增，获得1条约0.6 kb的清晰条带。用引物ITS1和ITS4测序后获得到521 nt的序列（登录号：MH908007），将该序列在NCBI上进行BLAST比对，并构建系统发育树，结果显示该病原菌的rDNA-ITS序列与山扁豆生棒孢（KX755 449.1、KU564090.1）的同源性达99%（图5），结合形态学鉴定结果，将该病原菌确定为山扁豆生棒孢[Corynespora cassiicola （Berk.&Curst.） Wei]。
　　2.5  不同温度对莲藕棒孢霉叶斑病病原菌菌落生长的影响
　　不同温度对LOBB001菌株菌丝生长的速率影响不同，病原菌在10～35 ℃内都可以生长，且菌落直径逐渐增大，在10～28 ℃内随温度升高，病原菌生长速较快;28～35 ℃生长速度减慢;病原菌在25～30 ℃适宜生长，当温度为28 ℃时生长最好，由此推断得出病原菌的最适温度为28 ℃（图6）。
　　2.6  不同pH对莲藕棒孢霉叶斑病病原菌菌丝生长的影响
　　不同的pH对LOBB001菌株菌丝的生长影响不同;pH 2时病原菌不生长，pH 3～11病原菌都能生长，当pH 3～7时病原菌的菌落直径大小呈逐渐上升的趋势，当pH 7～11时病原菌大小呈逐渐下降的趋势，因此病原菌的最适生长pH 7（图7）。病原菌在碱性环境下生长较快，在酸性环境下生长较慢。
　　2.7  不同碳源、氮源对莲藕棒孢霉叶斑病病原原菌菌絲生长的影响
　　2.7.1  不同碳源对莲藕棒孢霉叶斑病病原菌菌丝
　　生长的影响  LOBB001菌株在13种碳源培养基上均可生长，但对不同碳源的利用率存在差异。
　　其中，无水葡萄糖和D-木糖的利用率最高，D-半乳糖的利用率次之，肌醇和甘油的利用率最低（表1）。
　　2.7.2  不同氮源对莲藕棒孢霉叶斑病病原菌菌丝生长的影响  LOBB001菌株在12种氮源培养基上均可生长，但对不同碳源的利用率存在差异。其中，牛肉膏、大豆蛋白胨的利用率最高，酵母浸膏、硝酸钙的利用率次之，硫酸铵的利用率最低（表2）。
　　2.8  不同光照对莲藕棒孢霉叶斑病病原菌菌丝生长的影响
　　在不同光照条件下，病原菌菌丝的生长差异不显著，表明光照对LOBB001菌株的生长影响不大（图8）。
　　3  讨论
　　通过对海南莲藕棒孢霉叶斑病这一新病害病原菌致病性测定、孢子的形态特征观察和分子鉴定，确定其病原菌为山扁豆生棒孢[Corynespora cassiicola（Berk.&Curst.）Wei]。生物学特性测定表明：莲藕棒孢霉叶斑病病原菌是一种多寄主真菌，人工接种易侵染番木瓜、橡胶树、木薯、茄子较嫩的叶片;在28 ℃、pH 7、以牛肉膏为混合氮源或以硝酸钙为氮源、无水葡萄糖为碳源时菌落生长最好，光照或黑暗条件对其生长无明显影响。
　　山扁豆生棒孢[Corynespora cassiicola（Berk.&Curst.）Wei]可为害植物的叶片、茎、花、果实和根部，已报道侵染橡胶、番茄、黄瓜、茄子等300多种植物，并造成严重的经济损失[13-14]。肖敏等[15]报道引起节瓜褐斑病的山扁豆生棒孢的最适生长温度为30 ℃，最适pH 6，光照对该菌的生长有影响，以黑暗条件下生长最快，最适碳源为D-甘露醇和蔗糖，最适氮源为蛋白胨。这与本研究的结果差异较大。秦人全等[16]报道引起木棉褐斑病的山扁豆生棒孢在28 ℃、pH 6、麦芽糖和硝酸钠为碳氮源时生长最好，光照对该菌的生长没有影响，与本研究结果基本相同。张贺等[17]报道橡胶树棒孢霉落叶病的山扁豆生棒孢在28 ℃、pH 7、麦芽糖和蛋白胨为碳氮源时生长最好，光照对该菌的生长没有影响，这与本研究的结果基本相同。造成不同寄主上的山扁豆生棒孢生物学特性存在差异的原因，可能是为害不同寄主的山扁豆生棒孢菌株之间存在一定差异。
　　田间调查发现，海南莲藕棒孢霉叶斑病在每年7月开始发生，8月中下旬进入发病高峰，莲藕收获后病菌通过风雨传播侵染田间残留莲藕新抽的嫩叶进行越冬存活，这与陈雯等[7]报道由山扁豆生棒孢引起的莲藕褐斑病，在高湿、连续阴雨条件容易发生相一致。病菌的分生孢子可直接侵入并为害莲藕嫩叶。建议海南省在莲藕生产中可在每年7月初病害初发期选用对棒孢属真菌防效较好的多菌灵、甲基托布津等农药进行喷雾防治[3， 7]。
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