梅毒的临床分期特征及其实验室检测方法

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　　摘要：梅毒是被苍白密螺旋体苍白亚种（TP）感染后所引起的一种慢性全身性、性传播疾病。在患病早期，TP可通过黏膜或破损的皮肤侵入人体，累及人体多个系统和组织，严重影响患者生活质量和生命安全，已成为重大的公共卫生问题和社会问题之一。不同时期梅毒的临床表现、传染性、破坏力各不相同，目前实验室常用的检测方法包括直接镜检、血清学检验、聚合酶链反应检测等，可满足不同时期梅毒检测。本文就TP的结构特征、感染后不同时期梅毒的临床特征及实验室常用的TP检测方法作一综述。关键词：梅毒;结构特征;苍白密螺旋体苍白亚种;检测方法
　　中图分类号：R759.1                                文献标识码：A                                  DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.06.009
　　文章編号：1006-1959（2020）06-0027-04
　　Abstract：Syphilis is a chronic systemic， sexually transmitted disease caused by Treponema pallidum（TP） infection. In the early stage of illness， TP can invade the human body through mucous membranes or damaged skin， affecting multiple systems and tissues of the human body， which seriously affects patients' quality of life and life safety， and has become one of the major public health and social issues. The clinical manifestations， infectivity， and destructive power of syphilis are different in different periods. At present， the commonly used testing methods in the laboratory include direct microscopy， serological tests， and polymerase chain reaction tests， etc.， which can meet the syphilis detection in different periods. This article reviews the structural characteristics of TP， the clinical characteristics of syphilis at different stages after infection， and the TP detection methods commonly used in the laboratory.
　　Key words：Syphilis;Structural characteristics;Treponema pallidum;Detection method
　　梅毒（syphilis）是一种具有很强传染性的慢性、全身性的疾病，其主要的传播方式为性接触传播和血液传播。梅毒的病原体为苍白密螺旋体苍白亚种（treponemapallidum，TP），同时又被称为梅毒螺旋体，最初是由法国医学家Hoffmann等人于1905年在一位梅毒患者的淋巴结组织标本中发现。据世界卫生组织调查研究显示[1]，全球每年新发的由TP感染所致梅毒病例数约为1200万。截至目前，因TP对温度、湿度等环境因素的变化异常敏感，通过人工培养方式培养梅毒螺旋体尚未成功[2]，因此梅毒的血清学检测就显得尤为重要，已成为血站献血、临床患者在进行各种有创检查、操作以及手术和输血前的常规检查项目[3]。本文就TP的结构特征、感染后不同时期梅毒的临床特征及实验室常用的TP检测方法作一综述，以期提高广大群众对梅毒的认识，为临床筛查梅毒提供理论支持。
　　1 TP的结构特征
　　梅毒螺旋体型细长，两端尖直，呈现出螺旋状，同时弯曲规则，长度为（5～15 ）μm×（0.1～0.2）μm。TP由呈现螺旋形的圆柱状原生质体、内鞭毛和外膜组成，因此一般染料不易使其着色。
　　1.1抗原  抗原可分为3类： ①表面特异性抗原：此为其刺激机体产生的特异性凝集抗体以及密螺旋体制动或溶解抗体，且后者添加补体后可将螺旋体溶解;②螺旋体内类属抗原：此抗原可产生能与补体结合的抗体，与非病原性螺旋体之间会发生交叉反应;③复合抗原：此为螺旋体入侵宿主组织后与宿主组织中的磷脂结合而成的抗原。复合抗原可以刺激宿主产生抗磷脂的自身免疫性抗体，即反应素（Aegagin），可引起康氏反应和华氏反应。
　　1.2抗体  人体在被梅毒螺旋体感染后会产生两种类型的抗体：一类是特异性抗体，为lgM与IgG。当处于厌氧环境下和补体存在的情况时，活体螺旋体的动力会被此类抗体抑制，甚至还能被溶解或杀死，对于人体的再感染具有保护作用。另一类则是非特异性抗体，由螺旋体破坏了宿主组织细胞后细胞所释放出的类脂质样物质组成，这种非特异性的抗原能与正常生物组织中的类脂抗原发生非特异性反应，对人体并无保护作用。 　　2 TP感染后的临床分期
　　梅毒患者是梅毒的唯一传染源，螺旋体通常存在于患者破损皮肤处的黏膜、血液、精液、乳汁和唾液等处。性传播、垂直传播和血液传播是其常见的3种传播途径。根据不同时期梅毒的临床特征可将其分为以下5种：一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒、潜伏梅毒和先天梅毒（胎传梅毒）。
　　2.1一期梅毒  硬性下疳的出现和硬化性淋巴结炎的发生是一期梅毒的突出表现，但一般没有全身性症状的发生。在梅毒螺旋体入侵宿主大约3周后，感染部位即可出现溃疡或硬性下疳，硬性下疳触之有软骨样感，通常发于外生殖器，大约持续4～6周，因其溃疡渗出物中含有大量的TP，故一期梅毒的传染性极强，但多数情况下可自愈[4]。
　　2.2二期梅毒  二期梅毒不同于一期梅毒，它会发生全身性症状，以二期梅毒疹最为突出，一般好发于硬性下疳消退后再间隔一段无症状时期之后。梅毒螺旋体可伴随着血液循环播散至身体各处，造成全身多处淋巴结肿大，亦可累及骨、关节等其他器官，形成病灶和多部位的损伤。如若不采取临床干预，1～3个月后其临床症状通常能自然消退而全愈，但部分患者在经过3～12个月的潜伏期后可再次发作。若对二期梅毒治疗不充分，经过长时间的反复发作，患者就会进入三期梅毒。
　　2.3三期梅毒  三期梅毒的突出特点是皮肤粘膜的溃疡性损害或内脏器官的肉芽肿样变，也就是通常所说的梅毒瘤，此期梅毒病程长，通常在感染后2～15年发生，可累及机体任意组织和器官，造成各内脏、神经、皮肤、骨、关节等严重损害，可致残，严重者可危及生命安全。但此期患者病灶中存在的螺旋体很少，不易被检出[5]。一、二期梅毒合称为早期梅毒，此时期梅毒的传染性较强但是破坏力弱，而三期梅毒被称为晚期梅毒，该期梅毒的传染性弱但对人体的破坏力极大。
　　2.4潜伏期梅毒  有梅毒感染史，但无梅毒感染的临床症状或临床症状已消失，梅毒血清学检测为阳性，脑脊液检查为阴性，且无任何的阳性体征被称为潜伏期梅毒。潜伏期梅毒的发生往往与宿主的免疫力强或者临床治疗时用药剂量不足有关[6]。
　　2.5先天性梅毒  先天性梅毒又被称为胎传梅毒，是指梅毒螺旋通过母体胎盘进入胎儿的血液循环后，造成了胎儿的全身性感染，最终引起流产或死胎。若胎儿能继续存活则被称为梅毒儿，梅毒儿出生后通常会伴有皮肤梅毒瘤、骨膜炎、神经性耳聋等疾病[7]。由于目前尚未证明TP含有内毒素或分泌外毒素，这或许和TP对宿主细胞的直接损害还有Ⅲ、Ⅳ型变态反应的发生相关，但其致病机制尚未完全明确。
　　3实验室检测方法
　　3.1直接镜检法  此法适用于一、二期梅毒的早期筛查，主要包括暗视野显微镜镜检法、镀银染色法等。优点是操作简单、快速、方便，但结果判断受人为因素干扰较大，敏感性差。
　　3.1.1暗视野显微镜镜检法  暗视野显微镜镜检法的取材部位可以是一期梅毒硬性下疳的硬结、肿大的淋巴结穿刺液，也可以是先天梅毒损伤的皮肤黏膜和孕妇的羊水、胎盘，以及二期梅毒的粘膜斑、皮肤丘疹、脓疱等，在暗视野显微镜下进行观察时，若观察到运动的梅毒螺旋体，即确诊为梅毒[8]。暗视野显微镜镜检主要用于早期梅毒的筛查，然而当患者经过药物治疗后或标本留取不合格等因素都会降低梅毒螺旋体的检出率，因此其敏感性差，且由于此法無法区别TP和其他部位的非致病性螺旋体，因此不适合用于口腔、直肠等部位病灶标本的检测[9]。
　　3.1.2镀银染色法  镀银染色法能将TP染成棕褐色或黑褐色，染色后层次清晰，背景对比明显，形态易于辨认，且进行封片后可长久的保存，因此其TP检出率高于暗视野显微镜镜检法，但缺点是无法直接观察TP的运动情况。
　　3.2血清学检验  在TP感染人体1～2个月后，患者血清中可出现特异性抗体和非特异性抗体。特异性抗体是IgM与IgG，其出现时间早于非特异性抗体，且消失晚，被TP感染后两周，患者血清即呈现出反应。根据所检测的抗原种类不同，可分为两种检测试验，非梅毒螺旋体抗原血清试验和梅毒螺旋体抗原血清试验[10]。
　　3.2.1非梅毒螺旋体抗原血清试验  此试验利用的是梅毒患者血清中抗心磷脂抗体（反应素）能与正常牛心肌的心磷脂发生免疫反应，二者结合后发生凝集生成絮状物。此类试验主要针对于一期梅毒、二期梅毒和潜伏期梅毒的检查，可实现定量检测，还可作为疾病治疗效果的观察指标。具体的检测方法分为以下3种：①性病实验室试验（venereal disease research laboratory test，VDRL）：1946年，由美国性病研究实验室创建了此法，故以该实验室命名。VDRL的试验原理是以心磷脂为抗原来检测梅毒患者血清中的非特异性抗体，VDRL为了提高检测的灵敏性和抗原性还额外加入了胆固醇和卵磷脂。此试验在玻片上进行操作，在低倍镜下观察试验结果，对神经梅毒的诊断价值高，能对样本进行定性或半定量检测，因此操作简便、短时间内即可出结果，但其抗原悬液稳定性较差，待测血清标本需要加热灭活，且标本的新鲜度要求较高[11，12]。此外，VDRL还要借助于显微镜进行肉眼观察，导致其主观性强，漏检率高，适用于神经梅毒的脑脊液标本的检查。②快速血浆反应素试验（rapid plasma reagin，RPR）：RPR是在VDRL的基础上进行了改良升级，其抗原物质为心磷脂、卵磷脂及胆固醇的混合物，再以特制的活性炭颗粒进行吸附，若凝集形成了肉眼可见的黑色物质则报告为阳性，无需使用低倍镜进行观察。此试验经济、方便、快捷，但RPR试验也存在假阴性，特别是早期的一期梅毒、治疗后的梅毒以及潜伏期梅毒的假阴性率较高，敏感性和特异性有待提高，且肉眼判读检测结果的阴、阳性易被操作者的主观因素所影响，因此目前主要用于梅毒的筛查、治疗后疗效的观察，梅毒的复发及再感染的判断。③甲苯胺红不加热血清反应素试验（toluidine red unheated serum test，TRUST）：与RPR试验不同，TRUST试验是以甲苯胺红染料颗粒代替活性炭颗粒做吸附剂，阳性结果不再是形成肉眼可见的黑色凝集，而是在白色纸板上形成了红色的凝集颗粒，因此，TRUST试验也具有操作简便、迅速的优点。相对于RPR和TRUST这两种试验方法而言，TRUST的特异性均受限，易发生前带现象（指当梅毒患者血清中含有过多的抗体时，检测结果就易出现假阴性），造成漏检;此外，该试验还易与回归热、疟疾、麻风等疾病发生交叉反应，造成假阳性结果。 　　3.2.2毒螺旋体抗原血清试验  此类方法所用的抗原是TP自身或其自身的组成成分，以此来检测抗螺旋体抗体，因此具有较高的敏感性与特异性。具体的检测方法分为以下5种：①梅毒螺旋体血凝试验（treponema pallidum haemagglutination assay，TPHA）：TPHA也称为梅毒螺旋体红细胞凝集试验，反应体系在U型反应板孔中进行，以超声裂解后的TP为抗原，再致敏醛化和鞣化后的禽类红细胞，被致敏后的红细胞可以与待测血清中的TP抗体结合，产生肉眼可见的凝集。TPHA实验易操作、稳定性好，但该方法假阳性率较高，且常有自凝现象的发生。②梅毒螺旋体明胶凝集试验（treponema pallidum particle assay，TPPA）：TPPA是TPHA的改良方法，其以人工载体明胶粒子替换了TPHA的致敏红细胞，由于此实验的试剂制备过程中排除了各种非特异性，因此TPPA的敏感性、特异性高，在未经过药物治疗的二期梅毒患者当中的阳性检出率甚至能达到100%[13]，且对正处于潜伏期无症状患者而言，其检出率也十分可观，表明其敏感度较高，是目前全球范围内广泛被认可和应用的梅毒确诊方法，但TTPA仍需肉眼识别结果，且操作相对繁琐，不易实现自动化检测。③梅毒螺旋体荧光抗体吸收试验（fluorescent treponemal antibody-absorbed，FTA-ABS）：该试验原理是先以超声裂解后的非致病性Reiter密螺旋体处理患者血清，以去除具有交叉反应的抗体，再与TP发生免疫反应，加用荧光标记的二抗来显示TP抗体的存在，借助于荧光显微镜能精准的检测出细胞表面分子的存在与否及细胞内抗原或抗体所在的位置。该法排除了同属抗原交叉反应的可能，而且该法利用的是完整的一条TP进行检测，因此敏感性也较高，是血清学试验中检测TP的金标准[14]。FTA-ABS对于各个时期梅毒检测的特异性能达到90%以上[15]，在一期梅毒硬性下疳出现8 d后，FTA-ABS的检测结果即可呈现阳性，此外还能用于诊断先天性梅毒。但该方法对实验室的设备和所用试剂要求较高，检测过程中涉及到荧光显微镜和高质量的荧光标记抗体的使用，临床应用受限[16]。FTA-ABS对二期梅毒的检测敏感度弱于一期梅毒，因此临床检测过程中应注意患者的病情进展。④梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（treponema pallidum enzyme linked immunosorbent assay，TP-ELISA）：双抗原夹心法是此试验的核心技术，以TP抗原包被聚丙乙烯孔板，再加入待测血清标本及酶标抗原，用于检测患者的TP-IgM/IgG抗体。梅毒患者被药物治愈后，其体内的TP-IgG抗体仍可长期存在，甚至终身维持，因此，TP-ELISA的阳性结果只能说明患者曾经被TP感染过或正在被感染。TP-ELISA的试验结果由检验仪器进行自动分析，检测结果客观准确，且敏感性、特异性都较好，还可实现操作的自动化，性价比高，适合大规模样本的筛查，但不同厂家的TP-ELISA试剂盒质量参差不齐，临床使用前应对其进行评估。⑤梅毒螺旋体化学发光免疫分析（chemiluminescence analysis，CLIA）：利用TP的重组抗原（TpN15、17、47）去包被化学发光磁微粒来作为固相抗原，再用辣根过氧化物酶（HRP）来标记第二抗原，示踪剂采用的是含有鲁米诺和其增强剂的化学发光底物，是TP CLIA的核心技术，检测结果的报告是通过化学发光分析仪检测其发光数值。CLIA能将显色底物转变成化学发光底物，使得发光信号的时间得以延长，稳定性得以提高，CLIA的操作简便、灵敏度高、特异性强，是目前实验室检测TP特异性抗体中应用前景较为良好的一种检测方法[17，18]。研究表明[19]，CLIA检测各期TP抗体的敏感性在98%以上，而特异性高达99.9%。
　　3.3聚合酶链反应检测  聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）能对血清、脑脊液、皮肤破损部位组织液和淋巴结穿刺液在内的多种不同类型的标本进行多元化检测，此技术能够在梅毒患者的血清中直接探测出TP的特异性基因片段的存在，因此检测的敏感性与特异性较高，特别是针对如神经性梅毒、艾滋病合并梅毒、先天性梅毒等特殊類型梅毒的诊断具有重要意义。此外其检测时限低、重复性好、可实现定量检测，但与此同时PCR检测技术对实验室配置要求高、需要特殊仪器，一般用于科学研究和作为TP血清学试验的验证。目前常用的TP检测技术有常规PCR、实时荧光定量PCR、逆转录PCR、多重PCR、巢式PCR等。
　　实时荧光定量PCR是在PCR反应体系的基础上额外加入了荧光基团，通过对整个反应过程中荧光信号积累的实时测定以达到监测PCR反应过程的目的，然后通过标曲可对未知的标本进行定量检测。因其反应过程是在密闭空间进行，既避免了产物污染[20]，又克服了传统的TP检测手段的假阳性率高、敏感性差、不能定量等缺点[21]，对TP核酸进行检测的优势在于实时荧光定量PCR能够对早期梅毒、神经梅毒还是先天性梅毒等各个时期的梅毒进行诊断[22]，其对于正在发病患者的鉴别价值尤其明显。此项检测技术还在不断的发展优化中，赵丹等[23]经过试验构建出了TP重组质粒标准品和TP的二聚体蝎型探针定量PCR技术，为TP感染的早期诊断与治疗又提供了一项新技术。
　　梅毒的检测方法众多，直接镜检法操作简便，适用于梅毒的早期筛查，但是敏感性较差。血清学检测利用的是抗原抗体反应，可实现定量检测，还可作为疗效的观察指标，敏感性和特异性较好，但也存在假阳性结果。聚合酶链反应检测重复性好，敏感性与特异性高，特别是针对特殊类型的梅毒，但此法对实验室配置要求高，限制了其临床应用。总之，不同的检测方法存在各自的优缺点，需要临床医生提高对各期梅毒的认识，选择合理的检测方法，减轻患者的经济负担，必要时可多种方法联合应用，以防造成漏诊、误诊。 　　4总结
　　人类对于梅毒的各种检测仍处于技术探索阶段，实验室检测方法的不断发展，不仅提高了梅毒临床诊断的敏感度、特异度和准确性，特别是仪器的自动化检测系统能很大程度上减少检测人员主观性的错误。梅毒的实验室检测方法虽众多，但每种方法都有其各自的优缺点，目前尚无一种方法可全面满足梅毒的诊断、疗效观察等多重目的的需要。伴随着TP基因序列不断被人类深入了解和分子生物学的逐渐发展，相信对于梅毒的实验室诊断方法在未来会取得重大突破。
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　　收稿日期：2020-01-09;修回日期：2020-01-19
　　编辑/杜帆
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