鸡细小病毒与H9亚型禽流感病毒二重PCR检测方法的建立

来源:用户上传      作者:李丹 谢芝勋 李孟

　　摘要 [目的]建立一种能够同时诊断鸡细小病毒（chincken parvovirus，ChPV）和H9亚型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）的检测方法。[方法]根据GenBank中已发表的ChPV NS基因、H9亚型AIV HA基因的保守序列，分别设计多对引物，并通过一系列不同组合对温度和反应体系的调整试验，最终筛选出2对最佳特异性引物组合，建立了ChPV和AIV二重PCR检测方法用于ChPV和H9亚型AIV的检测。[结果]特异性和敏感性的试验结果表明，建立的二重PCR方法特异性良好，可以在一管PCR反应同时检测ChPV和H9亚型AIV。针对ChPV NS基因和H9亚型AIV HA基因的扩增片段大小分别为558和367 bp，其他常见的禽病病原体均未见阳性反应;该法对ChPV和H9亚型AIV的检测下限均为5×104拷贝/μL质粒;临床样品检测结果表明，对140份临床样品检测结果与AIV分离测序及ChPV PCR阳性产物测序结果完全一致。[结论]建立的ChPV和H9亚型AIV 二重PCR检测方法不仅特异性良好，而且检测的灵敏度高，对ChPV和H9亚型AIV的监测及有效防控具有重要意义。
　　关键词 鸡细小病毒;H9亚型禽流感病毒;二重PCR
　　Abstract [Objective] In order to establish a method to simultaneously detect chicken parvovirus （ChPV） and avian influenza virus（AIV）. [Method] Two pairs of specific primers were designed according to the sequences of ChPV NS genes， H9 subtype AIV HA genes which has been published in GenBank. Multiple pairs of primers were designed respectively， and through a series of experiments to adjust the temperature and reaction system of different combinations， the optimal combination of two pairs of specific primers was finally selected， and the duplex PCR detection method of AIV and ChPV was established for the detection of ChPV and H9 subtype AIV. [Result] The results of specificity and sensitivity test showed that the established triple PCR method was specific and good， and could simultaneously detect ChPV and H9 subtype AIV in one tube of PCR reaction. The amplified fragment size of the NS genes sequences of ChPV and HA genes sequences of H9 were 558 and 367 bp.The lower limit of detection for ChPV and H9 subtype AIV was 5×104 copies/μL plasmid.The results of clinical samples test showed that 140 clinical samples were completely consistent with the results of AIV isolation sequencing and ChPV PCR positive products sequencing. [Conclusion] The duplexPCR detection method for ChPV and H9 subtype AIV established in this study has not only good specificity， but also high detection sensitivity， which is of great significance for the monitoring and effective prevention and control of ChPV and H9 subtype AIV.
　　Key words Chicken parvovirus;H9 subtype avian influenza virus;Duplex PCR
　　雞细小病毒是引发鸡群肠道疾病的重要病毒之一，临床上以腹泻、呈现精神抑郁和生长迟缓及料肉比增加等为特征[1]。ChPV主要侵害雏鸡，造成患病鸡腹泻和发育不良，在某些鸡群中普遍存在，有研究发现在发育障碍与矮小综合征鸡群的血清中能检测出ChPV DNA[2]。流行病学调查表明，其在商品肉鸡感染率较高，蛋鸡或种鸡次之[3]。近年来研究表明，ChPV在全球多个国家鸡群中普遍存在，且近年相继在北美的美国和巴西、东欧的波兰、匈牙利、克罗地亚及亚洲的韩国和我国[4-6]等国家发现报道。
　　H9亚型禽流感病毒自1966年在美国被首次发现，随后我国广东地区也于1994年首次在发病鸡体内发现了该亚型AIV[7]。研究表明，H9亚型AIV容易与其他病原（病毒和细菌等）混合感染，进而给我国养禽业造成更为严重的损失;其与其他不同亚型AIV混合感染时，毒株间容易发生基因片段重组，并产生一些不可预知的新型禽流感病毒，进而可能引起新型禽流感病毒的大流行。2013年以来的部分报道还表明，其可为H5N6和H7N9等高致病性亚型AIV提供内部基因[8-10]。由上述报道可见，H9N2亚型AIV与ChPV都对家禽养殖业造成了严重的危害。 　　由于ChPV在正常鸡胚和细胞培养中难以大量增殖，因此应用病毒分离及电镜观察等方法对该病进行诊断的难度很大。传统AIV检测及诊断方法主要包括血清学鉴定、电镜观察和免疫荧光试验等[11]，这几种方法各有优势，但都存在检测时间长、准确性差和敏感度低等缺点。PCR技术可以直接检测组织或培养物中是否存在目标病原的核酸，快速且准确的判断样品有无该病原体感染。另外，多重PCR具有同时对多种病原体混合感染进行检测的优点，克服了常规单一PCR需要对混合感染样品进行逐项检测耗时长的缺点，且经过不断完善和改进后，该技术已被用于多种禽病及其他动物病原混合感染的诊断。为此，该研究根据ChPV的NS基因及H9亚型AIV HA基因的保守序列，设计2对针对2种病毒的特异性引物，建立了ChPV与H9亚型AIV二重PCR检测方法，不仅可以快速准确的鉴别上述2种不同病原的混合感染，而且为ChPV与H9亚型AIV的有效防控提供技术支撑。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 主要仪器和试剂。PCR仪购自美国Bio-Rad Laboratories公司;超微量分光光度计购自美国Thermo公司;2× PCR Super Mix，DNA/RNA共提试剂盒、小量质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、感受态细胞、PCR产物快速连接载体和DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司;M-MLV、随机引物、dNTP及RNA抑制剂购自宝生物（北京）有限公司。其他试剂均购自商业公司。
　　1.1.2 毒株。AIV毒株（H3N2、H6N2、H9N2、NDV、IBV、ARV、ILTV、ChPV、Adv4、RTV、aMPV、CAV、AHEV和MDV）均由广西兽医生物技术重点实验室保存;AIV（H7N2）的cDNA 模板由美国宾夕法尼亚州立大学惠赠;AIV毒株（H5N1）cDNA 模板均由美国康涅狄格州立大学惠赠。
　　1.2 方法
　　1.2.1 引物的设计与合成。根据GenBank中已经发表的ChPV NS基因和H9亚型AIV HA基因的核苷酸序列，采用DNAStar软件将下载的ChPV和AIV目的基因进行比对，进而筛选出它们的特异性保守区域，利用Primer6.0和Oligo6.0软件设计出2对特异性引物，然后通过NCBI BLAST对其特异性进行在线验证，引物设计的序列见表1。引物由赛默飞广州分公司合成。
　　1.2.2 病毒RNA/DNA的提取与RNA的反转录。
　　参照 DNA/RNA 抽提试剂盒使用说明书对AIV、NDV、IBV、ARV、ILTV、ChPV、Adv4、RTV、aMPV、CAV、AHEV和MDV的DNA/RNA进行抽提，抽提后的DNA/RNA用33 μLDEPC水溶解。RNA病毒的抽提产物参照反转录酶说明书进行反转录合成cDNA，所有产物置-30 ℃冰箱保存。
　　1.2.3 二重RT-PCR反应体系及条件的优化。
　　该方法运用25 μL PCR反应体系：2×TransTaq-T PCR SuperMix 12.5 μL，ChPV DNA和H9亚型AIV cDNA共2 μL作为模板，引物ChPV-F、ChPV-R、H9-F和H9-R（25 pmol/μL）各加入0.1～1.0 μL，10个梯度进行引物浓度的优化，最后用超纯水补足至25 μL。根据试验效果对退火温度及时间进行优化，最终确定最佳反应体系及条件。
　　1.2.4 特异性试验。
　　运用所建立的二重RT-PCR检测方法按照优化好的反应条件对H3N2、H5N1、H6N2、H7N2、H9N2、NDV、IBV、ARV、ILTV、ChPV、Adv4、RTV、aMPV、CAV、AHEV和MDV的RNA/DNA进行检测，验证该方法的特异性。
　　1.2.5 标准品的制备。
　　参考文献[12]的方法，用ChPV NS基因和H9N2 HA全长基因的引物，分别以H9N2与ChPV为模板进行RT-PCR扩增，得到其HA和NS基因的全长目的片段，并将这3个基因片段分别链接到pMD18-T的载体上。将含有H9 亚型AIV的HA基因和ChPV NS基因片段的正确序列重组载体分别命名为H9-T和NS-T。用质粒抽提试剂盒提取H9-T和NS-T的质粒，并用微量核酸检测仪对其进行核酸浓度的测定，根据分子质量和核酸浓度计算对应的拷贝数，将H9-T和NS-T等拷贝数混合，并进行10倍倍比稀释，以得到H9-T和NS-T质粒DNA浓度均为5×101～5×109拷贝/μL的标准品。
　　1.2.6 敏感性试验。
　　运用所建立的ChPV和H9亚型禽流感病毒二重RT-PCR的检测方法对H9-T和NS-T质粒浓度为5×102～5×107拷贝/μL的样品进行特异性扩增，检测该方法的敏感性。
　　1.2.7 臨床样品检测。
　　运用建立的二重PCR检测方法对活禽市场采集的140份鸡咽喉及泄殖腔拭子进行检测鉴定，同时将病料处理后接种SPF鸡胚进行病毒分离鉴定，并进行HA基因全长扩增。同时经ChPV NS基因阳性PCR产物和HA基因全长克隆送测序公司进行测序，然后将上述结果进行比较，验证二重RT-PCR的检测结果。
　　2 结果与分析
　　2.2 二重RT-PCR条件的优化
　　通过对H9亚型AIV HA基因和ChPV NS基因 2种引物浓度的测定及扩增温度时间等的优化，最终确定二重PCR最佳反应体系：2×TransTaq-T PCR SuperMix 12.5 μL，H9亚型AIV cDNA和ChPV DNA 各1μL作为模板，引物H9-F和H9-R（25 pmol/μL）各加入0.5 μL，引物ChPV-F 和ChPV-R（25 pmol/μL）则分别加入0.8 μL，最后用超纯水补足至25 μL。最终优化的反应条件为：95 ℃ 5 min;进入95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 min，共35个循环;然后再72 ℃延伸10 min。 　　2.2 特异性试验
　　该法对H9及ChPV混合感染样品检测出2条特异性的条带，分别为558（ChPV）及367 bp（H9亚型）;对ChPV检测结果仅出现1条特异性条带，片段大小为558 bp;对H9N2亚型AIV进行扩增检测出1条特异性条带，片段大小为367 bp;对其他亚型AIV未出现特异性条带，其他常见的禽病病原体均未扩增出任何条带，结果表明该方法具有良好的特异性（图1）。
　　48卷9期 李 丹等 鸡细小病毒与H9亚型禽流感病毒二重PCR检测方法的建立
　　2.3 敏感性试验
　　由图2可见，运用该方法针对5×103～5×107拷贝/μL的H9亚型AIV HA基因和ChPV NS基因质粒模板进行扩增，结果显示，对浓度为5×104～5×107拷贝/μL的H9亚型AIV HA基因和ChPV NS基因质粒均有2条明显的特异性扩增条带出现，片段大小分别为367和558 bp;对浓度小于或等于5×103拷贝/μL的H9亚型AIV HA基因和ChPV NS基因质粒均无扩增条带。由此可见，该法最低能检测到5×104拷贝/μL的H9亚型AIV HA基因和ChPV NS基因质粒。
　　2.4 临床样品检测
　　运用该方法对广西兽医生物技术重点实验室从南宁活禽市场采集的140份鸡口腔及泄殖腔的棉拭子样品进行了检测，检测结果显示有2份样品能同时扩增出367和558 bp的目的条带，为H9亚型AIV和ChPV混合感染阳性，有3份样品能扩增出367 bp的目的条带，为单一H9亚型AIV阳性，15份样品仅能扩增出558 bp的目的条带，为ChPV单一感染阳性，部分临床样品检测结果见图3。上述结果与病毒分离鉴定和HA基因测序结果100%相符，说明该方法有一定的实用性。
　　3 小结与讨论
　　AIV基因组由8个独立节段组成，分别为HA、NA、M、PB1、PB2、PA、NP和NS[13]。H9亚型AIV属于LPAIV，该病毒主要引起鸡群呼吸道、消化道和生殖系统的疾病，进而造成鸡的生长缓慢和产蛋率下降等不良影响，是目前影响我国养禽业的主要AIV亚型。大部分野禽、水禽和家禽携带该病毒时均不表现出任何明显的临床症状，但该病毒会对其机体造成一定的损伤[14]。AIV抗原在自然条件下容易发生变异，临床上易导致新亚型AI的出现，而且会发生多种亚型AIV的混合感染，其引起的症状又极其相似，给精确鉴别诊断造成了巨大困扰。在AIV的各种基因片段中，HA基因的变异最大，同时也变异最频繁，因此HA基因的分型鉴定引物需要不断的根据其变异进行更新。目前，雞的肠道疾病也是危害养鸡业健康发展的重要问题之一，其中由ChPV等病毒引起的鸡肠炎及腹泻等症状在临床上也十分常见[15]。ChPV感染会造成鸡群发生腹泻，也可能是隐性感染或者与其他病毒及细菌混合感染，进而引起鸡生长发育受阻，出现“僵鸡”及饲料料肉比下降等，给养鸡业造成了严重的经济损失[16 ]。另外由于ChPV引起的临床症状与其他病毒较相似，且在临床上极易呈现混合感染的病例，给临床鉴别诊断带来困难。目前尚无有效的疫苗防治ChPV感染。研究还发现，ChPV具有垂直传播的潜在可能，可能造成种蛋的孵化率下降及鸡胚发育不良增加。目前，国内虽没有关于ChPV暴发和流行的相关报道，但该试验对不同品种和日龄鸡群监测的结果表明，ChPV在某些品种和日龄鸡群的感染率依然很高。因此，对于ChPV的监测及防控也十分迫切和必要，建立一种快速鉴别诊断方法可以为该病混合感染的监测、鉴别及防控提供有力的技术支撑。
　　HA和HI方法也是目前世界卫生组织（WHO）和世界动物卫生组织（OIE）监测流感采用的一般方法，但是由于该方法需要对抗原和血清进行分型和标准化处理，而且其前期制备繁琐，成本高，加之禽流感病毒变异性强，血清的广谱性效果差，因此该方法的特异性和准确性有所欠缺[17]。目前利用RT-PCR方法对AIV进行鉴定与分型，也是WHO与OIE推荐的方法之一[18]。该方法快速准确、操作简便、平均样品检测成本相对较低，得到了广泛的认可与应用推广。近年来，国内外已有检测ChPV 的PCR诊断技术和方法的研究，而且同时检测多种病原体混合感染的多重PCR技术也有不少报道[19-20]。该研究建立H9亚型AIV与ChPV二重PCR检测方法，不仅可以快速诊断和鉴别上述2种疾病混合感染，也可快速诊断H9亚型AIV亚型或者ChPV单独感染。该方法的特异性试验结果显示，多种病毒混合感染时依然能特异扩增出目的基因条带;同时敏感性试验结果表明，当2种病毒混合感染的含量很低时，该方法还能清晰扩增出目的片段，说明建立的H9亚型AIV和ChPV二重PCR检测方法能够直接检测临床样品，可为临床上2种病毒性疾病的快速鉴别诊断提供技术支撑。
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