许氏平鲉网箱养殖系统菌群结构及其多样性的周年变化规律

来源:用户上传      作者:孙心如 王印庚 王凯

　　摘要 [目的]研究深海网箱养殖系统许氏平鲉（Sebastes schlegeli）肠道与环境中菌群结构的周年变化规律及其与疾病发生的相关性。[方法]采用高通量测序技术在2016—2017年一个年度内对同一网箱中不同月份许氏平鲉的肠道（Int）、海水（W）、冰鲜饵料（F）及网衣附着物（N）中的细菌多样性及群落结构进行比较分析。[结果]不同月份深海网箱养殖系统中菌群多样性为W>N>F>Int。温度和季节变化可影响养殖系统中前20种优势菌种丰度的排名次序，其中肠道与冰鲜饵料样品中发光杆菌属（Photobacterium）在2016年7、11月出现较大比重，对应的OTU数量占该样品全部OTU数量的28.07%、19.25%和8.99%、38.75%。同时，肠道与冰鲜饵料样品中弧菌属（Vibrio）在2016年8、9月，2017年6、8月样品中相对丰度显著上升，分别为5.72%、5.94%、8.40%和8.34%、6.08%、30.73%。PCoA图表明，加权与未加权条件下水样和网衣附着物样品菌群相关性较低，而肠道样品与冰鲜饵料菌样品群相关性较高。[结论]许氏平鲉深海网箱养殖系统周年内在温度较高的月份致病菌比例明显增加，冰鲜饵料作为病原菌主要载体，是影响肠道菌群结构的主要因素，成为网箱养殖系统鱼类发病的潜在隐患。
　　关键词 许氏平鲉;细菌多样性;群落结构;高通量测序
　　Abstract [Objective]To study the annual change of intestinal and environmental flora structure of Sebastes schlegeli in the deepsea cage culture system and its correlation with disease occurrence.[Method]The highthroughput sequencing technology was used to compare and analyze the bacterial diversity and community structure in the intestine （Int），culture water （W），chilled bait （F） and net attachment （N） of S.schlegeli in the same cage in different months from 2016 to 2017.[Result]The flora diversity in deepsea cage culture system in different months was W>N>F>Int.As the temperature and season changes，the order of the top 20 dominant species abundance in the survival system can be affected.Among the Int and F samples，the Photobacterium in the July and November 2016 samples had a large proportion.The corresponding number of OTUs accounted for 28.07%，19.25% and 8.99%，38.75% of the total OTU of the sample.At the same time，the relative abundance ratio of Vibrio in the Int and F samples in August，September，2016 and June，August 2017 were significantly increased，which was 5.72%，5.94%，8.40% and 8.34%，6.08%，30.73%，respectively.PCoA showed that under the weighted and unweighted conditions，the correlation between W and N was relatively small，while the correlation between Int and F was relatively large.[Conclusion]The percentage of pathogenic bacteria increased significantly in the month of higher temperature during the anniversary of S.schlegeli deepsea cage culture system.As a main carrier of pathogenic bacteria，chilled bait was the main factor affecting the structure of intestinal flora and became potential risk of fish disease in cage culture system.
　　Key words Sebastes schlegeli;Bacterial diversity;Community structure;Highthroughput sequencing
　　許氏平鲉（Sebastes schlegeli），隶属于辐鳍亚纲（Actinopterygi）、鲉形目（Scorpaeniformes）、鲉科（Scorpaenidae）、平鲉属（Sebastes），又称“黑鲪”或“黑石鲈”[1]，主要分布于太平洋西北部，鄂霍次克海南部，日本北海道以南，朝鲜东西两岸以及我国的渤海、黄海和东海沿岸水域等[2-3]。因其具有经济价值高，抗低温能力较强[4]，能够在我国北方海域自然越冬和度夏等优良性状，逐渐成为黄、渤海区域大型海水网箱养殖的主要鱼类品种之一。近年来，随着我国深海网箱养殖产业的发展，许氏平鲉的养殖规模和产量也在逐年增加，但病害发生率也逐年上升。近年来，以皮肤溃疡为代表的细菌性疾病[5]，在我国黄渤海海域大型深海网箱养殖的许氏平鲉中普遍发生，给许氏平鲉养殖业造成了较大的经济损失[6]。 　　疾病发生的三圈理论认为，养殖动物机体健康、环境和病原是疾病发生过程中的3个核心要素。在水产养殖环境中，微生物群落则承担着重要的微生态功能，菌群结构的变化可以全面或者部分反映养殖环境的变化情况[7]，进而作为疾病可能发生的预判指标之一。如养殖环境条件恶化时，病原菌可以大量增殖，打破原有的微生态平衡，改变稳定的微生物群落结构，最终导致养殖生物感染发病[8-9]。相比于传统的池塘或工厂化等养殖模式，深海网箱是一个开放的养殖系统，关于其微生物群落结构和功能的研究相对较少。
　　该研究在山东长岛地区许氏平鲉深海网箱养殖聚集区挑选其中的一口网箱作为研究对象，利用高通量测序技术，对养殖过程中的鱼体肠道、海水、投喂的饵料和网箱网衣附着物的细菌群落进行一个周年的跟踪监测研究，并分析其结构变化与养殖许氏平鲉皮肤溃疡症发生的相关性，以期进一步认识深海网箱养殖系统菌群结构的变化规律，为网箱养殖鱼类疾病发生的有效预警和科学防控提供借鉴。
　　1 材料与方法
　　1.1 样品采集
　　所有样品均采集于山东省长岛县大钦岛周边的许氏平鲉深海网箱养殖区固定的一口网箱，采样时间为2016年7月—2017年8月，共进行9次采样。每次采集的样品包括鱼、冰鲜饵料、海水和网衣附着物。其中，鱼样品为随机从网箱中钓取的许氏平鲉活鱼3尾（体重100～200 g），采用打包充氧的方式活运至实验室做进一步分析;饵料为投喂的冰鲜杂鱼，随机称取50 g放入采样袋中;用采水器采集2 L网箱中心点中层深度的海水样品装入无菌瓶中;采集一定量附着在网衣上生长的动植物样本放入采样袋中。上述所有现场采集的样本，均放入加有冰袋的低温采样箱中，带回实验室进行后续处理，样品明细及采集时间见表1。
　　1.2 样品处理 将带回实验室的许氏平鲉活鱼先放置于冰水中浸泡至休克状态，然后置于解剖盘中用70%乙醇棉球擦拭体表并用无菌海水冲洗，解剖剪取3 cm左右长度的肠道中段，放置于无菌培养皿中，用灭菌后的镊子轻轻挤出肠道内容物，再用注射器从肠道一端缓慢注射1 mL无菌海水进行冲洗，之后从中段剪取1 cm长度的肠道样品放入无菌试管中，匀浆后备用。饵料和网衣附着物样品用无菌海水冲洗2次后，各称取1 g，分别放入无菌试管中，匀浆后备用。采集的2 L海水水样经0.22 μm孔径的无菌纤维素滤膜抽滤，将滤膜放入无菌试管中剪碎，并滴加2～3滴无菌海水使其保持湿润备用。
　　1.3 细菌总DNA提取
　　经“1.2”处理的备用样品用美国OMEGA 公司的Soil DNA Kit试剂盒提取细菌总DNA，将提取后的DNA放入液氮罐中保存。其中鱼肠道样品分为3个平行样，海水水样、饵料样品和网衣附着物样品各设1个样品。
　　1.4 高通量测序分析
　　待上述所有样品的细菌总DNA全部提取完毕后，扩增16S rDNA序列的v3～v4可变区，引物序列为341F：CCTACGGGNGGCWGCAG;806R：GGACTACHVG GGTATCTAAT。PCR反应体系为15 mmol/L MgCl2的10×Buffer缓冲液 10.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，10 μmol/L引物各5 μL，5 U/μL Taq酶1.0 μL，DNA模板4.0 μL，灭菌去离子水73 μL，总体积100 μL。PCR反应条件为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸50 s，连续30个循环;最后72 ℃延伸10 min。每个PCR样本设置3个平行，所得产物混合后经20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，使用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，用Quanti FluorTM荧光定量系统进行定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合，送商业测序公司用Hiseq2500 PE250测序平台进行测序。
　　1.5 数据分析
　　测序得到的原始数据，经过拼接、过滤获得有效数据，用Mothur软件结合Excel进行数据统计和分析。以97%相似性为标准划分操作分类单元OTU （operational taxonomic unit）作为分类和计算的依据。基于OTU结果计算样本的ACE指数，用Excel分析并绘制属水平的相对丰度图，使用R语言的gmodels制作主成分分析图。
　　2 结果与分析
　　2.1 菌群α多样性分析
　　ACE指数是微生物多样性分析中常用的α多样性指数，以97%相似性水平为标准划分可操作分类单元（OTU），主要体现物种的丰富度信息，ACE指数大说明养殖环境菌群的丰富度高[10-11]。将9个时间点的样品数据进行统计，许氏平鲉肠道（Int）、海水（W）、饵料（F）及网衣附着物（N）的菌群ACE指数如图1所示。在一年9个时期的样品中，水样的ACE指数平均为1 847，是同期样品的最高值;其次是网衣附着物，ACE指数平均为1 395;而饵料与肠道的细菌种类丰富度较低，ACE指数平均为1 049和969。菌群多样性顺序为海水、网衣附着物、饵料肠道。菌落多样性也存在显著的季节性变化，海水样品的ACE指数表现为3月最高，8月最低，最高值为2 374，最低值为990;肠道样品的ACE指数随季节变化较稳定，在8月达到最高值1 195，11月为最低值757;饵料样品在5、6月ACE指数较高，分别为1 303、1 357;网衣附着物样品在9月ACE指数出现最高值1 735，11月最低818。
　　2.2 菌群结构组成及丰度分析
　　不同月份的肠道、海水、饵料及网衣附着物属水平细菌群落组成如图2所示。Int样品中柠檬酸杆菌属（Citrobacter）占有绝对优势，相对丰度为37.0%～49.8%;其次是不动杆菌属（Acinetobacter）和假单胞菌属（Pseudomonas）。其中2016年7、11月样品中出现较大比重发光杆菌属（Photobacterium），对应的OTU数量占该样品全部OTU数量的28.07%和19.25%。同时，在2016年8、9月和2017年8月样品中弧菌属（Vibrio）相对丰度明显增加，占比分别为5.72%、5.94%和8.40%。饵料样品与肠道样品的优势菌群结构组成非常相似，柠檬酸杆菌属仍为优势菌属，相对丰度为9.86%～22.85%。发光杆菌属和弧菌属在多个月份中也具有一定的优势，2016年7、11月發光杆菌属相对丰度分别为8.99%和38.75%，2016年8、9月和2017年6月弧菌属相对丰度分别为8.34%、6.08%和30.73%。同肠道样品和饵料样品菌群结构相比，海水水样与网衣附着物样品在属水平上无明显优势菌群，在分类上更加多样化，包括柠檬酸杆菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、发光杆菌属、弧菌属、Actinomarina属和浮霉菌属（Planctomyces）。 　　2.3 不同样品菌群相关性分析
　　Unifrac距离是用于比较生物群落的距离度量，其主要原理是利用各样品序列间的进化信息来比较样品在特定的进化谱系中是否有显著的微生物群落差异[12]。Unifrac包括weighted Unifrac（加权，定量）和unweighted Unifrac（未加权，定性），weighted Unifrac考虑生物群落的存在和丰度，而unweighted Unifrac仅考虑群落的存在[13]。为进一步研究肠道、饵料、海水及网衣附着物各样品之间的菌群相关性，在2种计算模式下对各样品进行PCoA分析（图3、4），图中的每一个点代表一个样本，两点之间距离越近表明两者的群落构成差异越小，可以通过PCoA图观察到各样本之间的相关性。图3为未加权条件下的PCoA图，表示在不考虑丰度的条件下饵料样品与肠道样品各样本之间距离比较接近，而网衣附着物样本与养殖水体样本各自聚集。表明肠道样品与饵料样品相关性很高，而与网衣附着物和养殖水体相关性较低。此时，2个主成分PCo1和PCo2贡献值分别为14.94%和7.30%。图4为加权条件下主成分图，在考虑微生物群落丰度的基础上，仍然是肠道样品与饵料样品相聚在一起，且聚合度比在未加权条件下更高。此时，2个主坐标共同解释了72.40%的群落差异。通过对肠道、饵料、海水及网衣附着物样品的定量与定性分析，证明饵料与肠道样品的相关性较高，与海水和网衣附着物相关性较小，饵料是影响肠道菌群的主要因素。
　　3 讨论
　　网箱养殖是一个开放的系统，水体温度、盐度、溶解氧等环境因子的变化均牵动养殖环境菌群多样性的组成[14-15]，相同条件下网箱养殖区内海水的菌群丰富度显著高于非养殖区，且同一养殖区在不同月份的微生物群落结构和多样性也存在显著差异[16]。该研究发现，长岛地区网箱样品菌群的ACE指数从大到小依次为海水、网衣附着物、饵料、肠道，研究结果与许燕等[17]对斑石鲷肠道、饵料与养殖环境菌群结构的多样性研究结论相似。吴建平等[18]和涂志刚[16]对大亚湾和海南后水湾深水网箱养殖区的细菌丰度和微生物多样性研究发现，海水ACE指数高峰期分别在5、11月，与该研究结果海水细菌多样性在3月最高（2 374）不同，这可能与温度有关，该研究采样地渤海海域的海水温度呈现明显的季节性波动，而处于热带地区的海南海域的全年海水温度总体上波动幅度不大，更适宜细菌的繁殖生长。
　　养殖区微生物群落的结构变化与鱼类病害的发生也有一定的相关性。金珊等[19]对浙江象山和奉化海水网箱养殖区域细菌动态进行了研究，发现温度高峰期是鱼病的频繁发生期。王凯[20]研究的长岛地区许氏平鲉的大规模死亡主要集中在6—11月，分离鉴定病原为轮虫弧菌（Vibrio rotiferianus）[21]和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种（Photobacterium damselae subsp.Damselae）[5]。该研究发现，弧菌属在
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　　8、9月海水、肠道及饵料样品中含量较高，且相对丰度达5.39%～10.80%，发光杆菌属在7、11月肠道和饵料样品中的相对丰度达到最高值，为8.99%～38.75%，与疾病暴发期相吻合。同时研究结果显示，在2016—2017年一个年度内冰鲜饵料菌群结构变化比较显著，致病菌呈现夏、秋季高，而冬、春季低的特点，说明在夏、秋季节冰鲜饵料作为许氏平鲉食物来源，极有可能携带大量致病菌，是病原菌导入养殖鱼体和养殖系统的主要来源渠道。肠道样品的菌群变化比较显著且与饵料相关性较高，作为鱼体的消化器官，肠道是致病菌的首要入侵部位，菌群平衡一旦遭到破坏，宿主就会因肠道菌群紊乱而发生各种疾病，导致鱼体死亡[22-23]。海水菌群结构变化比较稳定，仅在夏季出现较高的弧菌属，说明开放性海域水体的菌群结构并不稳定，海水的流动性和季节性的温度变化很有可能对其中菌群结构的稳定性造成了较大的影响。 　　水产动物肠道菌群结构与日常投喂的饵料关联紧密，饵料中携带的病原菌，添加益生菌、抗生素、微生态制剂[24-26]等都可以造成肠道菌群的结构发生明显变化。而肠道菌群对养殖动物的生长代谢、营养吸收、疾病发生[27-30]都有极其重要的作用。该研究发现疾病频发的夏季高温期，饵料和肠道样品中均出现较大比例的发光杆菌属细菌。PCoA图显示饵料样品与肠道样品相靠拢，表明肠道菌群与饵料菌群结构相关性较高，与海水和网衣附着物样品相似度较低，饵料成为影响肠道菌群结构的主要因素。该研究所采饵料样品均为冰鲜鱼虾，由于来源不稳定及长期存放易变质等客观原因，其中往往携带大量的病原微生物，成为导致该地区网箱养殖许氏平鲉发病的主要原因之一。国外学者在进行网箱养殖鱼类疾病发生原因的调查后，也认为冰鲜杂鱼是疾病发生的主要诱因之一[31-32]。对于网箱养殖系统而言，选择使用人工配合饲料，杜绝病原菌导入，是防控疾病发生的有效方式之一。
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