?莼菜中锌蛋白的分离及初步分析?

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　　摘 要：为了明确莼菜中锌蛋白的分布及氨基酸组成，以富硒高锌土壤中种植的莼菜为材料，对其幼叶蛋白质进行分离提取和分析。结果表明：莼菜中蛋白质主要类型为弱碱性蛋白质，比例为44.79%，但其锌含量相对较低，水溶性蛋白比例只有15.43%，但其锌含量却是弱碱性蛋白质中的2.17倍，表明大部分锌离子是与水溶性蛋白结合的;通过逐级盐析从水溶性蛋白中获得5个馏分，进一步分析各馏分的蛋白质含量及锌含量，获得WSⅡ和WSⅤ这2个高锌含量的蛋白质馏分，电泳分析显示这2个馏分分别由一个或一系列相同亚基组成;氨基酸组分分析显示，WSⅡ和WSⅤ中甘氨酸、硒代半胱氨酸、组氨酸和赖氨酸含量较高。
　　关键词：莼菜;锌蛋白;分离;氨基酸组成
　　中图分类号：Q513 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2020）04-0064-05
　　Preliminary Analysis and Separation of Zinc Protein in Brasenia schreberi
　　XIAO Wu-xuan1，WANG Kun-lun2，ZHOU Hai-yan2
　　（1. Hunan Institute of Nuclear Agriculture Science and Space Breeding， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， PRC;
　　2. College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC）
　　Abstract： Brasenia schreberi planted in selenium-rich and high-zinc soil was used as the target material in this study. The proteins in Brasenia schreberi young leaves were separated and analyzed for further clarification of zinc protein distribution and amino acid composition in the genus. The results show that the main type of proteins in Brasenia schreberi is weak alkaline protein， accounting for 44.79%， but its zinc content is relatively low; the proportion of water-soluble protein is only 15.43%， but its zinc content is 2.17 times that of weak alkaline protein， which indicates that most of the zinc ions are combined with water-soluble protein. Five fractions from water-soluble protein were obtained by stepwise salting out， then the protein content and zinc content of each fraction were analyzed， finally two protein fractions of high zinc content WSⅡ and WSⅤ were obtained. Electrophoresis analysis shows that these two fractions are composed of one or a series of the same subunits. Amino acid composition analysis shows that the contents of glycine， selenocysteine， histidine and lysine are high in WSⅡ and WSⅤ.
　　Key words： Brasenia schreberi; zinc protein; separation; amino acid composition
　　莼菜（Brasenia schreberi）又名蒪菜、马蹄菜、湖菜等，系睡莲目睡莲科莼属植物。莼菜为须根系植物，不定根簇生于地下匍匐茎的茎节靠近叶柄基部的两侧;茎可分为3类，分别是匍匐茎、缩短茎和水中茎[1];幼叶叶片呈现卷曲状态，且叶外有透明质胶包裹，可食用[2];花由花瓣、花托、花萼、花梗及雌雄蕊组成，花期为2 d，第一天呈现雌蕊的功能，第二天则是展现雄花的功能，白天花朵浮出水面，主要靠风媒传播授粉，夜晚花体沉入水中，于水中授粉结果，2～6周种子即可成熟[3]。莼菜在亚洲广泛栽培，可有性繁殖，也可无性繁殖。
　　莼菜的营养价值较高，富含可溶性植物多糖、蛋白质及一些微量元素。目前已经检测到的微量元素多达27种，其中锌元素的含量远超一般蔬菜[4]。此外，莼菜还含有膳食纤维及维生素B等物质[4]，是一种应用前景广阔的蔬菜。还有研究表明，莼菜提取物具有抗藻、抗菌和化感作用[5]。研究表明，莼菜多糖对小鼠的免疫系统具有明显的改善作用[6-9]。
　　锌是植物[10]、动物[11]和微生物[12]必不可少的微量元素，存在于数百种特定的酶中[13]。锌通常在转录因子中充当结构离子[14]，并且通过金属硫蛋白进行存储和转移[15]。对人类而言，锌有着更為普遍的生物学功能[16]。它与多种有机配体相互作用[16]，并在RNA和DNA的代谢、信号转导和基因表达中起作用，它还能调节细胞凋亡。除数百种参与交换和运输锌的蛋白质外，还约有10%的人类蛋白质可与锌结合。大量文献对莼菜叶片表层凝胶和多糖的结构和功能进行了阐述，但对莼菜中锌和蛋白质的研究较少。前期研究表明，锌在莼菜幼叶中的含量最高，并且与蛋白质结合的锌含量高于与多糖或其他有机分子结合的锌含量。因此，笔者以产自湖北省利川市（其耕地土壤富含锌和硒元素）的莼菜为材料，对蛋白质进行分离提取和分析，以期进一步明确莼菜中锌蛋白的含量、结构和功能。 　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　供试莼菜产自湖北省利川市，种植于利川市汪营镇富硒地区，土壤背景中硒含量为2.439 mg/kg。硫酸铵、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、浓硝酸和过氧化氢等试剂均为分析纯。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 蛋白质的分离与测定 （1）水溶性蛋白质提取。将5.000 g干燥的莼菜粉末悬浮在50 mL丙酮中脱脂2 h，5 000 r/min离心10 min去除上清液，重复操作2次;将脱脂之后的莼菜粉末在50 mL 50℃去离子水中搅拌2 h，以5 000 r/min离心20 min，保留上清液，重复提取2次，收集所有上清液;上清液于4℃下分别以浓度100%、80%、60%、40%和20%的硫酸铵进行盐析，5 000 r/min离心10 min，将沉淀物透析，并于磷酸缓冲液（0.2 mol/L，pH值7.4）中定容至100 mL，即得不同组分的水溶性蛋白质。（2）盐溶性蛋白质提取。将提取水溶性蛋白质时去离子水中的沉淀物悬浮在100 mL的0.1 mol/L NaCl中2 h，然后5 000 r/min离心20 min，保留上清液;用50 mL 0.1 mol/L NaCl萃取沉淀2次，合并萃取液;萃取液在4℃过夜以100%的浓度盐析;5 000 r/min离心20 min，将沉淀物透析，并用NaCl溶液稀释至100 mL，即得盐溶性蛋白。（3）弱酸性蛋白质提取。将提取盐溶性蛋白质时NaCl溶液中的沉淀物悬浮在100 mL的1/15 mol/L的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液（pH值6.0）中2 h，5 000 r/min离心20 min，保留上清液，用缓冲液重复提取2次;将所有上清液合并，4℃过夜以100%的浓度盐析，5 000
　　r/min离心20 min，将沉淀物透析，用1/15 mol/L Na2HPO4-KH2PO4缓冲液（pH值6.0）稀释至100 mL，即得弱酸性蛋白质。（4）弱碱性蛋白质提取。将提取弱酸性蛋白质时缓冲液中的沉淀物悬浮在100 mL的1/15 mol/L Na2HPO4-KH2PO4缓冲液（pH值8.5）中2 h;5 000 r/min离心20 min，保留上清液，用缓冲液重复提取2次;将所有上清液合并，在4℃过夜以100%的浓度盐析，5 000 r/min离心20 min，将沉淀物透析，然后用1/15 mol/L Na2HPO4-KH2PO4缓冲液（pH值8.5）稀释至100 mL，即得弱碱性蛋白质。采用Bradford法[17] 进行蛋白质定量分析。
　　1.2.2 锌含量测定 在微波消解罐中，将10 mL蛋白质溶液与7 mL浓硝酸和2 mL过氧化氢混合，消化温度在15 min内升至150℃，然后在10 min内升至205℃，保持40 min后，温度冷却，将消化液补足至100 mL。通过原子吸收光谱法[18]测定锌含量。
　　1.2.3 柱色谱和电泳 蛋白质样品首先通过Sephadex G-75柱子，富锌组分依次通过Sepharose 6B柱子[19]。纯化的蛋白质通过电泳鉴定[17]。
　　1.2.4 氨基酸成分分析 将50 μL蛋白质样品及其水解产物混合，105℃下用氩气均化24 h;再用RT-HPLC分析水解产物，条件为：250 mm×4.6 mm×5 μm C18柱、温度45℃、检测波长245 nm[20]。
　　2 结果与分析
　　2.1 莼菜不同类型蛋白质中的锌含量
　　莼菜幼叶中蛋白质的锌含量最高。根据蛋白质特征，可分为水溶性蛋白质（WS）、盐溶性蛋白质（SS）、弱酸性蛋白质（WA）和弱碱性蛋白质（WB）。这4类蛋白质中的锌含量测定结果如图1所示。莼菜的幼叶中，蛋白质的主要类型是弱碱性蛋白质，其比例为44.79%，但是锌含量相对较低。水溶性蛋白比例只有15.43%，但其锌含量却是弱碱性蛋白质中的2.17倍。从上述结果来看，水溶性蛋白质值得进一步研究。
　　2.2 莼菜水溶性蛋白质中的锌含量
　　从锌的含量来看，水溶性蛋白质以0～20%（WSⅠ）、20%～40%（WSⅡ）、40%～60%（WSⅢ）、60%～80%（WSⅣ）
　　和80%～100%（WSⅤ）的分馏形式盐析出来，分析了这5个馏分中水溶性蛋白质的含量及其锌含量，结果如图2所示。WSⅠ中蛋白质含量最高，占水溶性总蛋白质的47.98%，但其锌含量较低，比例为15.90%;WSⅡ和WSⅤ这2个馏分中锌浓度较高，分别为7.011 2
　　和7.998 7 mg/g。因此，这2个馏分适合进一步纯化分析。另外，值得一提的是WSⅣ馏分中蛋白质和锌的含量在各馏分中是比较平衡的，分别占比20.26%和26.00%。
　　2.3 柱色谱分离蛋白质
　　通过柱色谱法进一步分析了WSⅡ和WSⅤ这2个馏分。流经Sephadex G-75后，WSⅡ和WSⅤ的主要成分没有显着差异，只是除去了微量的蛋白质，其保留时间均为3.1 min，回收的蛋白质中锌浓度分别为7.012 3和8.001 0 mg/g，没有任何损失。这表明在WSⅡ和WSⅤ馏分中，锌与蛋白质是结合在一起的。
　　从图3中可以看出，在Sepharose 6B色谱柱中WSⅡ和WSⅤ的保留時间均为30 min左右（仪器分析具体时间为34.6和33.9 min），2种组分的洗脱体积均大于内部体积。因此，Sepharose 6B可以有效分离WSⅡ和WSⅤ。回收蛋白质中的锌含量分别为8.44和9.56 mg/g。
　　2.4 锌蛋白电泳和氨基酸组成
　　分离后，通过SDS-PAGE检测回收的蛋白质，结果如图4所示，在WSⅡ和WSⅤ中回收的蛋白质是一个或一系列由相同亚基组成的蛋白质，但是WSⅡ中的亚基与WSⅤ中的亚基分子量不同。 　　根据参考文献，用C18反相柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）分析了WSⅡ和WSⅤ中回收的富锌蛋白质的氨基酸组成，结果如表1和图5所示。从WSⅡ中回收的富锌蛋白质由天冬氨酸（D）、甘氨酸（G）、组氨酸（H）、精氨酸（R）、脯氨酸（P）、酪氨酸（Y）、
　　缬氨酸（V）、半胱氨酸（C）、硒代半胱氨酸（Se-C）、赖氨酸（K）等组成;其中，甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸的比例较高，占比为84.98%。此外，趋于与锌结合的组氨酸、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、精氨酸和赖氨酸的比例也高达43.58%。从WSⅤ中回收的富锌蛋白质由天冬氨酸（D）、甘氨酸（G）、组氨酸（H）、苏氨酸（T）、丙氨酸（A）、脯氨酸（P）、酪氨酸（Y）、硒代半胱氨酸（Se-C）等组成;其中，甘氨酸、酪氨酸、组氨酸、丙氨酸和硒代半胱氨酸的比例较高，占比为95.79%，而倾向于与锌结合的组氨酸和硒代半胱氨酸的比例为12.10%。
　　3 讨 论
　　该研究所选莼菜材料种植在富含锌元素的土壤中，因此其锌含量较一般地区高，是一种理想的锌补充剂。试验结果表明，在该材料中，幼叶的锌含量很高，且其倾向于与水溶性蛋白质结合。纯化后发现，莼菜幼叶中2种锌结合水溶性蛋白（WSⅡ和WSⅤ）分别由一个或一系列相同亚基组成。通过RT-HPLC的氨基酸分析，蛋白质WSⅡ和WSⅤ的甘氨酸、硒代半胱氨酸和组氨酸的含量高，另外WSⅡ中的赖氨酸含量也较高。在蛋白质中，锌离子通常与天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和组氨酸的氨基酸侧链配位[20]。因此，WSⅡ和WSⅤ的硒代半胱氨酸和组氨酸含量很高也就不足为奇了。硒代半胱氨酸替代半胱氨酸的原因是莼菜生长的土壤中硒元素含量较高。这些结果表明，生长在湖北利川地区的莼菜由于其高锌含量及丰富的氨基酸组成而具有良好的营养品质，具有较好的开发
　　前景。
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