茭白胡麻叶斑病病原菌分离与鉴定

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　　摘要 茭白胡麻叶斑病发生普遍且严重，已成为茭白的常见病害。为了明确病原菌，先后从茭白主产区采集胡麻叶斑病病叶，各产区分离纯化5～10株病原菌。通过对菌株DNA的内转录间隔区ITS基因、3-磷酸甘油醛脱氢酶GPDH基因、延伸因子EF-1α基因的序列进行分析。结合形态学观察、致病力测定等方法对茭白胡麻叶斑病病菌进行鉴定。结果表明，茭白胡麻叶斑病病原菌为稻平脐蠕孢Bipolaris oryzae，与水稻胡麻葉斑病病原菌一致。本文的研究成果可为茭白胡麻叶斑病的防治提供一种新的思路。
　　关键词 茭白胡麻叶斑病; 病原菌鉴定; 稻平脐蠕孢
　　中图分类号： S 436.45  文献标识码： A  DOI： 10.16688/j.zwbh.2019060
　　Abstract Zizania latifolia leaf spot disease is a common and serious disease. In order to identify the pathogen， we collected infected leaves from different main production areas of Z. latifolia and selected 5 to 10 strains in each area. Identification experiments were performed based on DNA internal transcribed spacer ITS， glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase （GDPH） and elongation factor EF-1α gene sequences and morphology. The results showed that the pathogen of leaf spot of Z. latifolia was Bipolaris oryzae， which was the same as the pathogen of rice flax leaf spot. This study provides a new idea for the control of leaf spot of Z. latifolia.
　　Key words Zizania latifolia leaf spot disease; pathogen identification; Bipolaris oryzae
　　 茭白Zizania latifolia，又名高笋、茭瓜，是我国第二大水生蔬菜，也是我国特有蔬菜，经济效益非常显著[1]。由Bipolaris oryzae引起的茭白胡麻叶斑病又称茭白叶枯病，是近年来影响茭白产量的主要病害之一。随着茭白种植面积逐年扩大，该病的发生范围也在不断扩大，在全国茭白主要种植区都普遍发生[2]，而且田间发生程度也越来越严重，特别严重时，株发病率达90%，病叶率达100%[1]。为了弄清不同茭白主产区胡麻叶斑病病原菌，本研究对茭白五个主产区的胡麻叶斑病菌进行了分离纯化、形态学观察、致病力测定和分子鉴定，以期为茭白胡麻叶斑病的诊断、抗病育种以及病害防治提供理论依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 主要生物试剂及仪器
　　DNA提取的相关试剂、药品购自大连宝生物公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒为爱思进生物技术有限公司产品。本试验所涉及引物均委托武汉天一辉远生物技术有限公司合成，使用引物序列详细信息见表1。
　　PCR扩增仪（DNA Engine Peltier Thermal cycler，Bio-RAD）;水平电泳仪（DYY-6C，北京）;凝胶成像系统（Gel Doc TMImager，Bio-RAD）;微量分光光度计（Nano Drop 2000c，Thermo Scientific公司）;光学显微镜（Nikon ECLIPSE 80i，Nikon Instruments Inc）。
　　1.2 菌株采集与分离
　　在2016年7月-2017年11月期间共采样8次，茭白胡麻叶斑病叶采自湖北武汉市与恩施州，浙江桐乡县与金华市，江西九江市，江苏南通市与扬州市以及广西贵港市等茭白主产区。病原菌的分离纯化方法参照组织分离法[3]，即：取茭白叶片病健交界处，剪切成5 mm×5 mm的小块，用75%乙醇消毒30 s，灭菌水清洗3次后接种于PDA平板上，每皿4～5块，置于28℃光照培养箱中暗培养2～4 d，再纯化菌株。将成功分离纯化的病株用PDA培养基斜面接种保存后，在4℃冰箱中保存（本试验筛选菌株情况见表2）。
　　1.3 致病力测定
　　采用离体叶片接种法[4]，该试验共进行2次，每次试验设3个重复。在茭白生长初期取宽约2 cm的叶片进行室内人工接种试验。从田间采回叶片后剪取其中部约7 cm的一段，置于铺有湿润吸水纸的培养皿中，叶背朝上，用直径为5 mm的菌丝块进行接种，每皿3组重复加1组PDA培养基琼脂块作为空白对照。接种后喷水雾，将培养皿盖住保湿，置于28℃恒温黑暗条件下，观察24～96 h，待叶片出现染病状态后将菌饼移除，96 h后对病斑进行组织分离，观察菌落形态以及在显微镜下观察分离到的病菌是否与接种病菌相同。
　　1.4 菌株形态学特征观察
　　将已分离纯化的菌株接种在PDA培养基平板上，培养3代后用打孔器沿菌落边缘切取直径为5 mm的菌丝块接种于PDA培养基上，在28℃培养箱中黑暗培养约15 d，期间观察菌落的颜色以及在PDA培养基上的菌落形态等。在病原菌长满平板前在显微镜下观察菌丝尖端，待长满平板后，用无菌水将菌落表面的孢子洗下，在显微镜下进行观察。
　　1.5 菌株DNA的提取 　　菌株基因组DNA提取采用CTAB法[5]，核酸溶解后取100 ng产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，剩余产物置于-20℃条件下保存备用。
　　1.6 基因扩增体系及条件
　　对溶解后的DNA核酸溶液进行质量检测，然后再进行基因扩增。EF-1α基因扩增体系为25 μL，DNA模板1 μg，dNTPs （2.5 mmol/L）2 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，引物各1 μL，Taq酶1 U，加滅菌水至25 μL。反应程序为：95℃预变性5 min;95℃变性30 s ，58℃退火1 min，72℃延伸1 min 30 s，循环30次;最后72℃延伸7 min。基因GPDH和基因ITS扩增体系为25 μL，DNA模板1 μg，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，引物各1 μL，Taq酶1 U，加灭菌水至25 μL。基因EF-1α反应程序为：95℃预变性5 min;95℃变性30 s，54℃退火50 s，72℃延伸1 min，循环40次;最后72℃延伸5 min。基因ITS反应程序为：95℃预变性5 min;95℃变性30 s，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环35次;最后72℃延伸7 min。
　　由于EF-1α基因引物为简并引物，故将其扩增产物连T载体克隆后送武汉天一辉远公司测序检测，其他基因将扩增产物委托公司进行双向测序。检测结果分别得到菌株的EF-1α基因序列、ITS基因序列和GPDH基因序列。将测序结果用DNAMAN 7.0软件进行分析，然后登录NCBI（National Center for Biotechnology Information）的BLASTn后与GenBank数据库中公布相关属种病原菌基因信息作同源性比较分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 茭白胡麻叶斑病病菌危害症状
　　茭白胡麻叶斑病一般出现在5月下旬到7月上旬之间，在6月下旬到7月中上旬发病速度明显加快，7月中旬后开始进入发病高峰期，到9月中旬发病速度开始变缓，进入11月后发病逐渐停止[2]。在叶片发病初期，叶片上散生褐色小点，后逐渐扩大成状如芝麻粒的褐色椭圆形或纺锤形病斑（图1a）。病斑周围呈黄褐色晕圈，时有轮纹，后期中心变灰白色。病情严重时叶片上分布着密密麻麻的病斑，甚至联合成不规则的大斑，造成较大的坏死区，致使叶片由叶尖或叶缘向下或向内逐渐枯死，最后叶片干枯。
　　2.2 形态学鉴定结果
　　病原菌在PDA培养基上生长良好，初期菌落为灰白色，2～3 d后从中心开始变为淡灰色（图2a），之后逐渐扩散，28℃黑暗培养7 d后，菌落能长满直径为90 mm的培养皿（图2b）。长满整个培养皿后菌丝变为褐绿色，最终菌落呈黑褐色，圆环形，菌丝绒毛状，呈辐射状展开，边缘规则，中心部分或有气生菌丝，或产生白色菌丝团，培养15 d左右气生菌丝铺满整个培养皿。显微镜下分生孢子深黄褐色或浅褐色，长卵形、梭形或者倒棍棒形，光滑，正直或一侧弯曲，两端渐狭，钝圆，4～9个假隔膜，脐部略突出，基部平截，长33～188 μm，宽6～41 μm（图3）。菌丝尖端疏散铺开，有向一侧弯曲的分支，或短或长（图4）。
　　
　　2.3 致病力测定结果与分析
　　胡麻叶斑病病标样分离得到的37株菌株接种离体叶片致病力测定结果表明，所有菌株对茭白叶片均能致病，接种后发病率为100%。96 h时，病斑长度增加到3～5 cm左右。人工接种茭白和水稻叶片后，在叶片上表现的症状相同（图1c）。
　　2.4 茭白胡麻斑病病原菌的分子鉴定
　　提取所有菌株基因组DNA且酶处理后，在220 V，45 min电泳条件下检测基因组完整性。部分菌株检测结果见图5。
　　 对提取成功的核酸进行含量检测，每个菌株取1 μg进行特定基因扩增。rDNA-ITS、GPDH和EF-1α基因目的条带分别约580 bp、550 bp和1 000 bp（图6）。扩增后的电泳图目的条带片段大小跟预测值接近。
　　
　　 测序结果分析发现37株菌株的rDNA-ITS基因序列完全一致，故选取BD73为代表菌株。根据构建的系统发育树，发现BD73与稻平脐蠕孢MFLUCC10-0694菌株MFLUCC10-0733菌株、MFLUCC13-0511菌株、MFLUCC10-0715菌株、CPC28828菌株、CPC28826菌株聚在一支。同时发现，菌株BD73与这些菌株的rDNA-ITS基因同源相似度在99%。
　　
　　 测序结果分析发现37株菌株的GPDH基因序列完全一致，故选取BD73为代表菌株。根据构建的系统发育树，发现BD73与稻平脐蠕孢MFLUCC13-0511菌株、BRIP：61686a菌株和平脐蠕孢有性态菌株WKIC聚在一支。同时发现，菌株BD73与菌株MFLUCC13-0511的GPDH基因同源相似度在100%。
　　
　　 37株菌株的EF-1α基因序列有30种不同的序列，将这些序列进行BLASTn比对后，发现这些菌株均与B.oryzae/ATCC44560（99%）、B.oryzae/MFLUCC13-0511（99%）、B.austrostipae /BRIP 12490（99%）、B.zeicola/26-R-13（99%）、B.victoriae/FI3（99%）、B.woodii/BRIP 12239（99%）、A.alternata/UFAH00014（95%）、Alternaria sp./CBS 174.52（96%）、C.cassiicola/624.1相似，且相似度在95%以上。故选以上序列和不同序列的BD73、ES16、M12和TX33为代表菌株，构建NJ树。根据NJ树结果，发现BD73、ES16、M12、TX33与稻平脐蠕孢菌株ATCC44560和菌株MFLUCC13-0511在同一支。 　　3 小结与讨论
　　虽然茭白胡麻叶斑病在茭白叶片上危害程度非常严重，但由于茭白的地理分布以及种植分布的局限性。长期以来人们对于茭白胡麻叶斑病的重视程度不够，导致对该病的研究较少。对于该菌的鉴定传统方法为观察病原菌分生孢子，通过测量分生孢子的长度来判断种类[6-7];长于153 μm即認定为菰平脐蠕孢，小于153 μm则认定为稻平脐蠕孢[8]。后来发现根据形态分类并不准确[9]，稻平脐蠕孢和菰平脐蠕孢的分生孢子大小并没有明显的界线将两者分开。本次对茭白胡麻叶斑病病原菌的形态鉴定也证明了这点。在对所分离的样本进行形态特征观察的过程中，采取PDA培养基作为病原菌产孢培养基。发现在PDA培养基上不同菌株产孢量差异较大，有些菌株甚至不产孢，因此很难单从形态学上鉴定是菰平脐蠕孢还是稻平脐蠕孢。关于菌株产孢量与菌株致病力的强弱、菌株不同来源等方面的潜在关系还有待进一步探究。
　　随着生物技术的发展，分子分类学的方法开始应用于真菌的鉴定与分类。近些年，已陆续有学者通过rDNA-ITS、GPDH、EF-1α三个基因对平脐蠕孢属及其相似属种进行分类鉴定[10-12]。本研究对茭白胡麻叶斑病病原菌的rDNA-ITS、GPDH、EF-1α三个基因序列分别进行鉴定，将采自湖北、浙江、江苏、江西和广西五个主产区的茭白胡麻叶斑病的病原菌鉴定为稻平脐蠕孢Bipolaris oryzae，与水稻胡麻叶斑病病原菌[13]一致。本研究在对该病害病原菌的鉴定、侵染等方面的研究，可以结合水稻胡麻叶斑病的研究成果，为茭白胡麻叶斑病的防治提供新的思路。
　　参考文献
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　　[13] 陈洪亮.水稻胡麻叶斑病病原菌的分离鉴定及生物学特性研究[D].合肥：安徽农业大学，2012.
　　（责任编辑： 田 喆）
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