南宁市桑白粉病病原菌种类鉴定

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　　摘要 桑白粉病是桑树的重要病害，分为桑里白粉病和桑表白粉病。通过形态特征观察和ITS、D1/D2序列分析，明确桑里白粉病的病原菌为桑生球针壳Phyllactinia moricola;桑表白粉病的病原菌为桑白粉菌Erysiphe mori。桑钩丝壳Uncinula mori是桑白粉菌的异名。
　　关键词 桑里白粉病; 桑生球针壳; 桑表白粉病; 桑白粉菌
　　中图分类号： S 888.716
　　文献标识码： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018327
　　Abstract Powdery mildew is an important disease on mulberry， which is divided into mulberry powdery mildew on leaf back and mulberry powdery mildew on leaf surface. Based on morphological characteristic and the nucleotide sequences of ITS and D1/D2， it was confirmed that the pathogen causing powdery mildew on the leaf back was Phyllactinia moricola， and the pathogen causing powdery mildew on the leaf surface of mulberry was Erysiphe mori.Uncinula mori is the synonym of Erysiphe mori.
　　Key words mulberry powdery mildew on leaf back; Phyllactinia moricola; mulberry powdery mildew on leaf surface; Erysiphe mori
　　随着国家“东桑西移”战略的实施，近年来广西大力发展桑蚕业，2012年，广西桑园面积16.88万hm2，蚕茧产量25.60万t，蚕丝产量2.88万t[1]，位居全国第一;至今，在全国范围内，广西桑蚕产业仍占第一位[2]。桑白粉病是桑上的一种重要病害，病害的发生导致桑叶产量降低、质量变劣，喂食感染白粉病的桑叶的家蚕体质弱，易诱发蚕病，蚕茧量、茧层量、茧层率均降低，严重影响蚕丝产业[3]。根据白粉产生的部位不同分为桑里白粉病和桑表白粉病。桑里白粉病在桑叶背面产生白粉斑，在白粉斑相应的桑叶正面可见淡黄褐色病斑[3];桑表白粉病可在桑叶正背面产生白粉斑，但以叶面为主。有关桑白粉病的病原菌种类，早年郑儒永等[4]根据形态特征和寄主范围鉴定桑里白粉病的病原菌为桑生球针壳Phyllactinia moricola，桑表白粉病的病原菌为桑钩丝壳Uncinula mori;随着分子生物学技术的发展，结合形态学特征和核苷酸序列的分析，白粉菌的分类系统被多次修订，多种植物白粉病病原菌的种名也发生了变化。有关桑白粉病菌的分子生物学鉴定，仅见杨俐针对来自云南的菌株进行了鉴定，报道桑里白粉病的病原菌为桑生球针壳P.moricola[5]，但未见基于分子生物学基础鉴定桑表白粉病菌种类的报道。本文针对南宁市发生的桑里白粉病和桑表白粉病，结合形态特征和分子生物学技术，鉴定其病原菌的种类，对规范使用桑白粉病菌的学名具有重要意义。
　　1 材料与方法
　　1.1 桑白粉病标本的采集及其病原菌形态特征观察
　　于广西大学农场采集桑白粉病标本，用刀片轻轻刮取叶片表面的白色粉状物、用毛笔轻轻扫下桑叶片表面的黑色小颗粒，用光学显微镜（OLYMPUS CX31）观察病原菌的形态特征。
　　参考陈廷速等[6]的甘蔗根系染色方法稍作改进后对桑白粉病病叶进行脱色，观察病原菌的菌丝体形态特征。透明：将发病嫩叶切成1 cm×1 cm的正方形小块，放入50 mL离心管中，加入20%KOH溶液浸没叶片，离心管放入90℃的水浴锅中，水浴90 min，取出后室温放置20 d;脱色：将浸泡20 d的离心管中的KOH溶液倒掉，加入碱性H2O2（10%的H2O2 30 mL，氨水3 mL，蒸餾水967 mL），漂白60 min;染色：将离心管中的脱色液倒掉，加入5%乙酸95 mL和黑墨水5 mL的混合液，66℃水浴染色30 min;褪色：染色完成后，倒去染色液，用清水冲洗数次，然后清水浸泡30 min。将叶片取出置于载玻片上，盖上盖玻片轻压，用光学显微镜观察。
　　1.2 病原菌ITS和28S rRNA D1/D2区域序列分析
　　用毛笔分别扫下桑里白粉病叶片背面的白色粉状物、桑表白粉病叶片正面的黑色小颗粒，用Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit（杭州博日科技有限公司）提取真菌基因组DNA，用真菌的内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）和28S rRNA D1/D2区域引物进行PCR扩增。ITS引物：ITS1： 5′TCC GTA GGT GAA CCT GCG G3′; ITS4： 5′TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC3′[5]; 28S rRNA D1/D2区域引物：NL1：5′GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG3′; NL4：5′GGT CCG TGT TTC AAG ACG G3′[7]。
　　PCR 反应体系20 μL：模板DNA 1.0 μL（20 ng/μL）、上下游引物各1.0 μL（10 μmol/L）、2×Es Taq Master Mix（北京康为世纪生物科技有限公司）10.0 μL、ddH2O 7.0 μL。PCR扩增程序：94℃预变性2 min;94℃变性30 s，ITS 48℃退火30 s，D1/D2 50℃退火30 s，72℃延伸40 s，进行30个循环;最后72℃延伸5 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，获得清晰的单一预期条带后直接送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将所得序列在NCBI的GenBank中与已知序列进行BLAST比对。 　　2 结果与分析
　　2.1 桑白粉病的症状
　　桑里白粉病发病初期叶背产生白色近圆形或不规则形的小粉斑，后向四周扩展成边缘不明显的白色斑片，严重时整个叶片背面布满白粉，即病原菌无性阶段的分生孢子，在白斑相应的桑叶正面可见淡黄褐色病斑。在南宁市，12月初，病斑上产生黄褐色和黑色小颗粒，为病原菌有性阶段的闭囊壳（图1）。
　　2.2 桑里白粉病菌的形态特征
　　分生孢子单生在菌丝顶端，棍棒状，无色，大小为（55～85）μm×（20～30）μm。菌丝无色，细长无分枝，顶端逐渐变粗，中间无隔膜，仅在顶端与分生孢子相连接处有2个相邻的隔膜，隔膜相距30～50 μm，成熟的分生孢子从最顶端的隔膜处断裂。菌丝体上有对生的附着胞，少数两个附着胞生在一侧，也有少数单生一个附着胞（图3）。
　　2.3 桑表白粉病菌的形态特征
　　菌丝体透明，有分枝，有隔膜;分生孢子单生，由分生孢子梗顶端断裂形成短圆柱形或椭圆形的分生孢子，无色或淡黄色;直径50～70 μm（图5）。
　　2.4 桑里白粉病菌ITS区域序列分析
　　用ITS1和ITS4引物对PCR扩增出的ITS序列长度为620 bp（图7），经过BLAST分析，与NCBI的GenBank中桑生球针壳P.moricola（AB080540.1）的同源性为99%，覆盖率为99%。
　　2.5 桑表白粉病菌的ITS和28S rRNA D1/D2区域的PCR扩增及序列分析
　　2.5.1 桑表白粉病菌ITS的PCR扩增及序列分析
　　用ITS1/ITS4引物扩增出桑表白粉菌的ITS序列长度为622 bp（图8），经过BLAST分析，与NCBI的GenBank中的桑白粉菌Erysiphe mori（KY910120.1）的同源性99%，覆盖率96%。
　　2.5.2 桑表白粉病菌28S rRNA D1/D2区域PCR产物扩增及序列分析
　　3 结论与讨论
　　白粉菌的传统分类方法主要依据其寄主和有性世代闭囊壳内子囊的个数及子囊孢子的数目来进行的[8]。但近年来，随着分子生物学和扫描电镜技术在病原菌鉴定中的广泛应用，发现传统的分类方法并不全面，有些有性世代相同，但无性态的分生孢子却截然不同[9]。Braun把白粉菌属分为三个组，即白粉菌属的白粉菌组Erysiphe sect. Erysiphe，戈洛文组Erysiphe sect. Golovinomyces和鼬瓣花白粉菌组Erysiphe sect. Galeopsidis。这三个组的无性型明显不同，其中Erysiphe sect. Erysiphe组的在一天内只产生一个分生孢子，为单生型（Pseudoidium型），分生孢子梗具有裂片状附着器;其他两个组的分生孢子均为串生的[10]。因此，将分生孢子单生的保留在白粉菌属Erysiphe内[12]，Gelyuta 1988年将串生的Erysiphe sect. Golovinomyces提升为属，即戈洛文属Golovinomyces （U. Braun）V.P.Gelyuta[10];以鼬瓣花白粉菌Erysiphe galeopsidis为模式种建立了一个新属，定名为新白粉菌属Neoerysiphe U. Braun[11]。现在，该分类方法已被大多数学者认可。狭义的白粉菌属Erysiphe s. str.在形态上与钩丝壳属Uncinula十分接近，并通过一些中间类群彼此相连。钩丝壳属的种在假粉孢支系中构成了基部的一个亚分支，包括大多数钩丝壳属的种和几个狭义白粉菌属的种[10]。因此Braun & Takamatsu将钩丝壳属作为白粉菌属Erysiphe的异名[12]，桑钩丝壳Uncinula mori作为原钩丝壳属中的一种，也应该归为白粉菌属。
　　本文通过对病原菌的形态特征观察和ITS、D1/D2基因的序列分析，明确了桑里白粉病的病原菌为桑生球针壳Phyllactinia moricola;桑表白粉病的病原菌为桑白粉菌Erysiphe mori，桑钩丝壳Uncinula mori这个学名不再使用，是桑白粉菌的异名。
　　参考文献
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　　（责任编辑：田 喆）
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