草莓、辣椒枯萎病菌的分离、鉴定及化学防治

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　　摘 要 由尖孢镰刀菌引起的辣椒枯萎病及草莓枯萎病是为害辣椒和草莓的主要病害之一。为明确淮安地区辣椒、草莓枯萎病的病原菌种类及防治方法，采集辣椒、草莓根际土壤样品，对其病原菌进行了分离、纯化和鉴定。结果表明，该病原菌为尖孢镰刀菌辣椒专化型及尖孢镰刀菌草莓专化型。采用菌丝生长速率法对3种杀菌剂进行筛选，其中氟硅唑抑制作用较好，对尖孢镰刀菌辣椒专化型的EC50为0.181 7～0.251 7 μg·mL-1，对尖孢镰刀菌草莓专化型的EC50为0.076 0～0.212 8 μg·mL-1，且活体药效实验表明该药剂有效。
　　关键词 辣椒枯萎病;草莓枯萎病;尖孢镰刀菌：氟硅唑
　　中图分类号：S436.418;S436.68 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.09.068
　　近年来，辣椒、草莓的种植面积越来越大，已成为我国主要的经济作物。辣椒是人们餐桌上较为普遍的食材，其种植面积仅次于大白菜;草莓因果实色泽亮丽、营养价值较高，而备受栽培者和消费者的喜爱[1-4]。但随着辣椒的连年种植及种植面积的逐年增多，辣椒病害发生也越发严重，其中由镰刀菌引起的辣椒枯萎病是辣椒生产栽培中最典型的病害之一。我国辣椒枯萎病发病率一般为15%～30%，个别地区严重时高达70%～80%，造成巨大经济损失。随着草莓种植面积的不断扩大，品种的不断更新，频繁地调种、引种以及连作也导致了草莓枯萎病蔓延。再加上草莓灰霉病、白粉病、蛇眼病、炭疽病、红中柱根腐病、根结线虫病、病毒病和革腐病等不断发生且越发严重，给栽培者带来较大的经济损失[5-7]。
　　目前，国内外关于辣椒枯萎病、草莓枯萎病致病菌的报道有很多。对由尖孢镰刀菌引起的辣椒枯萎病、草莓枯萎病的防治方法一般仍以化学防治为主，常用恶霉灵、多菌灵和甲基托布津和代森锰锌等杀菌剂进行灌根防治，但因连年使用这些药剂，防治效果逐年降低，甚至达到无法控制的程度[8-9]。由于该病害很难通过植物抗病防御及抗性育种的方法防治，因此研究选用化学杀菌剂氟硅唑、吡唑醚菌酯和氰烯菌酯对辣椒枯萎病和草莓枯萎病进行了药剂实验。据报道，氰烯菌酯对小麦赤霉病及水稻恶苗病均有良好的防治效果，但对辣椒枯萎病的防治是否有效果还未见报道;氟硅唑、吡唑醚菌酯在番茄颈腐病与根腐病的防治上有较好的防治效果[7]，但对草莓枯萎病的防治是否有效鲜有报道。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验材料
　　实验品种为淮安红椒、红颜草莓。
　　供试杀菌剂为氟硅唑、吡醚菌酯和氰烯菌酯，由江苏农药研究所提供。药剂存放于0～4 ℃环境中。
　　1.2 尖孢镰刀菌专化型的分离纯化与鉴定
　　从植株根际土壤中分别采取辣椒与草莓土样10 g，各采取5组土样。放入250 mL三角瓶中，加入90 mL的无菌水，在25 ℃的条件下进行离心。然后吸取1 mL悬浮液，采用浓度梯度法按照10-3、10-4、10-5和10-6浓度进行稀释，并均匀涂布于含有硫酸链霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）平板上进行培养。菌落生长完整后，从中筛选出镰刀菌并保存。
　　1.2.1 真菌菌丝培养和DNA提取
　　将分离纯化得到的菌株全都转接到PDA平板上，在25 ℃温度不变的条件下培育3～5 d后，在菌落边缘打取直径为5 mm的菌碟10～15个，放入配制好的PDB培养基中，在28 ℃的条件下振荡培养，再经过多次过滤离心等操作后可得到尖孢镰刀菌菌丝。将得到的菌丝在0～4 ℃下冷藏，作为提取真菌DNA的干组织。采用真菌DNA提取試剂盒对真菌DNA进行提取。
　　1.2.2 PCR与琼脂糖凝胶电泳分析
　　对不同专化型的尖孢镰刀菌种群的IGS序列经Primer 5设计了一对特异性引物对P1/P2：P1为5′-CAGGGTAGGCAGCTTAGATTTGG-3′，P2为5′-GACGGATTTGGCGAACCTACCCT-3′。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。通过该引物对P1/P2对尖孢镰刀菌IGS序列进行PCR扩增。
　　1.3 尖孢镰刀菌专化型对各组杀菌剂的敏感性测定
　　用菌丝生长速率法测定尖孢镰刀菌对各种杀菌剂的敏感性。将氟硅唑、吡唑醚菌酯和氰烯菌酯分别溶解在甲醇中，药剂浓度梯度为：0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1和0.8 mg·mL-1。将尖孢镰刀菌在28 ℃条件下恒温培养3～5 d，挑选生长均匀的菌落，在菌落边缘打取直径为5 mm的菌碟，然后将菌碟接种到含有氟硅唑、吡唑醚菌酯和氰烯菌酯不同浓度梯度的PDA平板上，测试菌株对药剂的敏感性。
　　25 ℃条件下恒温连续培养5 d后测量各菌株的菌落直径，以在不含药剂的平板上生长的菌株为对照，根据公式1计算菌丝生长抑制率，每个处理重复3次，试验重复3次，测量菌落直径时选取生长较为均匀的菌落，取平均值。根据药剂浓度的对数（X）与抑制率对应的机率值（Y），求出各菌株对于3种药剂的EC50。
　　1.4 活体药效实验
　　将尖孢镰刀菌在28 ℃下恒温连续培养3～5 d，在菌落边缘打取直径为5 mm的菌碟10～15个，放入配置好的PDB培养基中，在28 ℃条件下恒温振荡培养5 d，经过离心过滤等操作后可以得到尖刀镰孢菌孢子。
　　将得到的尖刀镰孢菌孢子接种至草莓根部，接种孢子2 d后，处理组用各种杀菌剂分别灌根，药剂稀释1 000倍，每株施用100 mL，每2 d灌药1次，对照组采用清水灌根，20 d后观察植株的生长发病情况。
　　1.5 数据处理
　　采用EXCEL、DPS等进行数据处理和做图。
　　2 结果与分析
　　2.1 草莓枯萎病菌及辣椒枯萎病菌形态学及分子生物学鉴定 　　从草莓和辣椒根际土壤中分别分离到3个菌株（编号为草莓0号、3号和7号，辣椒0号、3号和7号），他们的菌落和形态学特征无明显差异。如图1A所示，平板培养结果表明，病原菌在PDA培养基培养5 d后，菌落呈红色，外部为白色，气生菌丝为绒状。
　　如图1B常规PCR结果显示，特异性引物P1/P2可稳定地从100 pg·μL-1的尖孢镰刀菌基因组DNA模板中扩增得到一条1 081 bp左右的条带，而对土壤中病原菌DNA的检测实验中，能清晰得到特异性条带，长度约为1 100左右。即可确认实验中分离所到的菌即为尖孢镰刀菌。
　　2.2 不同杀菌剂对草莓和辣椒枯萎病的防治效果
　　尖孢镰刀菌草莓专化型和辣椒专化型的抑菌作用测定结果表明，杀菌剂氟硅唑对分离出菌株的抑制效果明显，在设定浓度范围内，随药剂浓度的增加，抑菌效果呈明显增强的趋势。
　　由表1可以看出，杀菌剂氟硅唑对分离出的尖孢镰刀菌有很好的抑制作用，对尖孢镰刀菌草莓专化型的EC50为0.076 0～0.212 8 mg·L-1，对尖孢镰刀菌辣椒专化型的EC50为0.181 7～0.251 7 μg·mL-1。
　　2.3 尖孢镰刀菌活体药效实验
　　将尖孢镰刀菌草莓专化型和辣椒专化型孢子分别接种草莓和辣椒幼苗20 d后观察幼苗发病症状。结果显示，发病初期叶片稍微卷缩，有些则呈波状，会产生畸形叶茎，老叶呈现紫红色萎蔫，后叶片逐渐变枯黄，最后全株枯死。
　　如图2A所示，左侧为成活的无病害草莓苗，右侧为处理组实验20 d后情况。对照组CK无明显发病症状;处理组孢子液蘸根并灌清水的草莓苗20 d后枯萎死亡;处理组孢子液蘸根并经常用氟硅唑水溶液灌根的草莓苗无发病症状，正常生长。表明氟硅唑对尖孢镰刀菌草莓专化型具有一定的抑制活性，对于草莓枯萎病的防治有一定的效果。
　　如图2B所示，左侧为成活的无病害辣椒苗，右侧为处理组实验20 d后的生长情况。对照组CK无明显发病症状;处理组孢子液蘸根并灌清水的辣椒苗20 d后枯萎死亡;处理组用辣椒3号和7号孢子液蘸根并经常用氟硅唑水溶液灌根的辣椒苗有轻微的发病症状，用辣椒0号孢子液蘸根并经常用氟硅唑水溶液灌根的辣椒苗正常生长。表明氟硅唑对尖孢镰刀菌辣椒专化型具有一定的活体抑制效果，对于辣椒枯萎病的防治有一定的指导意义。
　　3 结论
　　草莓和辣椒枯萎病是近年来生产上遇到的较难防治的土传病害，在我国一些主要种植区普遍发生，为害程度也逐年加重。尤其是在多年连续种植的重茬地块发病率更高，病害暴发严重时会直接造成毁园。
　　实验从淮安市农科院温室草莓种植区中找到疑似枯萎病的植株，从根际土壤中分离出来菌株，确认为草莓枯萎病的病原菌尖孢镰刀菌，并从中选出致病性强的尖孢镰刀菌，分别从形态学和分子生物学对其进行了验证。通过菌丝生长速率法，发现氟硅唑对于引起草莓枯萎病的尖孢镰刀菌防效良好，EC50在0.076 0～0.212 8 μg·mL-1。同样对辣椒病样进行取样分离、纯化、药剂防治和活体药效试验，发现氟硅唑对尖孢镰刀菌辣椒专化型的防效良好，EC50为0.181 7～0.251 7 μg·mL-1。
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　　（责任编辑：赵中正）
　　收稿日期：2020-02-26
　　基金项目：江苏省高等学校自然科学研究面上项目（18KJB210001）。
　　作者简介：王文（1997—），男，江苏宿迁人，本科，從事园艺学方向的研究。
　　为通信作者，E-mail： zztsdta@yeah.net。
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