微生物辅酶Q10高产菌株理性选育

来源:用户上传      作者: 王 娅 郑 毅 沈少娟 陈金聊

　　 [摘要]辅酶Q10是一种新型的生化药物,常作为保健品、食品以及化妆品的添加剂,在医药和化妆品领域具有广泛的应用前景。近年来,Q10的研究与开发越来越受国内外学者的关注。本文概述了微生物辅酶Q10合成代谢途径、代谢定向育种等方面的研究进展。
　　 [关键词]辅酶Q10微生物理性育种
　　
　　 辅酶Q10(CoQ10)又称为泛醌,为2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-二苯醌的侧链带有10个类异戊二烯的衍生物,在真核细胞内与线粒体内膜相结合,在原核细胞内则存在于细胞质膜中,是呼吸链的重要递氢体[1]。它是细胞自身合成的天然抗氧化剂和细胞代谢的激活剂,具有提高机体免疫力的功能,因而是一种临床价值很高的生化药物。它可用于治疗心脏病、胃溃疡、病毒性肝炎;还具有抗肿瘤、治疗圆形脱发和肺气肿的功能;对艾滋病和帕金森症有显著的辅助治疗[2]。在化妆品和保健品市场中,辅酶Q10对延缓衰老和提高机体免疫力有着不可代替的作用[3]。随着生活水平的提高,近年来人们对它的需求量不断攀升,从而促进了辅酶Q10产品生物加工的发展
　　 目前,辅酶Q10的生产主要依赖于微生物发酵法,受限于发酵的效价低,造成生产成本居高不下。本文主要对目前微生物辅酶Q10的研究现状、高产菌株的选育思路以及发酵工艺控制方面进行概述,为大规模的工业化生产提供一定依据。
　　1微生物法生产辅酶Q10
　　 辅酶Q10的生产方法一般分为直接提取法、化学合成法、微生物发酵法等。直接提取法受到原材料辅酶Q10含量的限制且受原料及季节等的限制,提取成本高,不适合于现代化工业大生产。化学合成法制得辅酶Q10为顺反异构体混合物,生物活性低,同时合成过程反应复杂、步骤多、且转化效率低、往往还存在许多副产物,这些因素都严重影响了其产业化的发展[4]。
　　 微生物发酵法是目前生产辅酶Q10的最主要生产方法。该生产方法由于原料廉价丰富,产物分离过程相对简单,产物为天然品,不存在手性问题,生物活性好,易被人体吸收,且可以通过发酵罐实现规模化工业化生产,因此成为最有发展潜力的辅酶Q10生产方法。迄今为止,国内外报道的辅酶Q10产生菌大多为细菌[5-8],表1列出主要的产辅酶Q10微生物。通常微生物发酵产生辅酶Q10的产量在30~130mg/L,据估计要实现商业化生产辅酶Q10的产量应该高于500mg/L[9]。日本是最早开发辅酶Q10的国家,但从近几年的发展趋势来看,中国正成为辅酶Q10原料药的生产中心。
　　2辅酶Q10高产菌株选育策略
　　2.1 应用代谢调节理论推理选育高产菌
　　 在对辅酶Q10生物合成途径及其调控机制研究基础上,利用代谢工程的定向选育高产菌株,优化代谢途径,可达到提高辅酶Q10发酵水平的目标。目前主要代谢控制策略:(1)强化辅酶Q10组件的生物合成,即强化莽草酸途径、MEP途径与甲硫氮酸合成途径;(2)切断或减弱支路通量,解除其末端产物对辅酶Q10代谢流的分流与反馈抑制,例如莽草酸途径也产生芳香族氨基酸、类胡萝卜素等;(3)强化葡萄糖代谢流量,解除葡萄糖分解代谢阻遏,实现高浓、高效转化。
　　表1辅酶Q10主要产生菌
　　 菌株 CoQ10浓度mg.L-1 CoQ10含量mg/g-DCW 参考文献
　　烟曲霉Aspergillus fumigatus 37.8 4.2 (7)
　　荚膜红细菌Rb. capsulatus -- 5.3 (11)
　　类球红细菌Rb.sphaeroides 97.2 2.7 (10)
　　类球红细菌Rb.sphaeroides突变株Co-22-11 350 8.7 (9)
　　根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens 87.6 8.5 (6)
　　放射型土壤杆菌Agrobacterium radiobacter 60.0 -- (9)
　　脱氮副球菌Paracoccus denitrificans 27.6 0.86 (9)
　　
　　*通讯作者:郑毅。
　　
　　2.1.1选育营养缺陷型突变株
　　 Olson和 Rudney[12]发现胡萝卜素合成和辅酶Q10合成具有共同的前体,胡萝卜素分支是辅酶Q10合成中的一股强大的代谢流。胡萝卜缺陷型菌株可以切断β-胡萝卜素的代谢流,从而增加与辅酶Q10合成的共同前体GGPP的积累与供给,提高辅酶Q10的产量。Hajime Yoshida等[9]获得R. sphaeroides绿色突变株的Q10胞内含量比野生型提高3.6倍。研究表明,通过选育L-苯丙氨酸缺陷、苏氨酸、L-酪氨酸缺陷或色氨酸缺陷等营养缺陷型突变株以阻断不必要的代谢支路,增加甲硫氨酸和SAM合成途径中各酶基因尤其是限速酶的拷贝数及表达量,可以提高SAM的产量,为合成辅酶Q10提供富足的前体[14]。
　　2.1.2选育抗反馈调节的突变株
　　 (1)耐前体突变株选育
　　 在辅酶Q10生物合成的中,每合成一分子产物需要一分子对羟基苯甲酸(PHBA),一分子聚异戊二烯焦磷酸(PPP),还需要S-腺苷蛋氨酸(SAM)和O2的供给,因此要提高辅酶Q10产量必须保证前体的协同供给。L-乙基硫氨酸是L-蛋氨酸的结构类似物,因此选育抗前体L-乙基硫氨酸突变株,可以解除蛋氨酸对高丝氨酸转乙酰基酶的反馈抑制和对胱硫醚裂解酶和转甲基酶的阻碍,有利于辅酶Q10的大量积累。王普等[15],对实验室自行筛选的辅酶Q10 产生菌株―季也蒙假丝酵母( Candida guilliermind) CG108进行诱变,并结合L-乙基硫氨酸耐前体突变株的理性化筛选,获得一株辅酶Q10高产菌株PN251。
　　 (2)耐终产物突变株选育
　　 选育抗类似物突变株是目前代谢控制育种的主要方向[16]。在辅酶Q10的合成途径中,终产物可能抑制产物的大量合成。Vk3是辅酶Q10的结构类似物,因此利用类似于Vk3等辅酶Q10结构类似物来遗传性的解除对代谢关键酶的抑制作用,使得在细胞中已经有大量终产物的情况下仍能不断合成所需产物。张向阳等[17],以根癌土壤杆菌( A. tumef - aciens) 突变株WSH2E01为出发菌株,通过进一步的诱变处理,获得L-乙硫氨酸和维生素K3 (VK3 ) 双抗性突变株WSH2V01,与出发菌株WSH AT12 相比,突变株WSH2V01 在优化后的发酵条件下辅酶Q10 产量达到29. 5 mg/L 。
　　 (3)解除葡萄糖分解阻遏突变株
　　 当发酵培养基中葡萄糖浓度提高到一定浓度时,会抑制菌体的生长与产物生成,这可能是由于某些酶的合成被容易分解利用的碳源所阻遏。因此选育解除葡萄糖分解阻遏突变株,增加葡萄糖代谢通量,从而促进了辅酶Q10的合成。
　　2.1.3 应用细胞毒性物质筛选高产菌株
　　 在培养基中添加放线菌素D、罗红霉素等细胞毒性物质对菌体细胞产生胁迫毒害作用。由于辅酶Q10是一种能提高机体免疫力的生理活性物质,筛选抗细胞毒性物质的菌株,可以获得高产辅酶Q10的菌株。此筛选模型大大加快了高产菌株的选育过程。潘春梅等[18],以放射型根瘤菌(Rhizobium radiobacter)WSH2601为出发菌株,经紫外线和亚硝基胍复合诱变,获得遗传稳定性好的抗放线菌素D突变株WSH-F06。
　　 在辅酶Q10的选育过程中,仅选用单一的一种育种策略是远远不够的。通常情况是基于广谱性的选育手段(如通过紫外处理、辐射处理、细胞毒性物质等[19]),再结合针对辅酶Q10某些合成途径设计的选育模型进行复合育种,从而获得辅酶Q10高产菌株。

　　2.2 应用代谢工程理论构建辅酶Q10工程菌
　　 利用基因工程理论改变细胞内代谢调节机制也是获得高产菌种的一个重要策略。
　　2.2.1莽草酸途径及代谢工程育种
　　 基于对大肠杆菌代谢途径的不断探索和深刻认识,以及菌体自身的优良条件,目前对其进行基因工程改造较为成功[20]。在大肠杆菌中,通过提高辅酶Q10合成途径中ubi基因的表达可以提高辅酶Q10前体的流通量,从而获得大量的终产物。Barker[21]等通过选择性地表达莽草酸途径中的几个酶,同时限制芳香族氨基酸的通量,使对羟基苯甲酸的产量达到了12g/L。
　　2.2.2聚异戊二烯焦磷酸合成(PPP)途径及代谢工程育种
　　 由于大肠杆菌主要是合成辅酶Q8,而通过基因工程原理改造辅酶Q10异戊二烯侧链聚合的关键酶,从而使其大量合成辅酶Q10。Cheong等[22]将聚十异戊二烯焦磷酸(DPS ) 基因和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因一起插入载体pGPRX11中,通过质粒转化入Agrobacterium tumefaciens BNQ-pGPRX11-(KCCM-10554)中表达,得到辅酶Q10的高产菌,通过发酵工艺优化后产率达到6.69 mg/ g,工业化生产前景较好。
　　2.2.3甲基引入策略
　　 大肠杆菌中,芳香环修饰的第一步是PHBA和PPP的缩合反应,催化此反应的酶是对羟基苯甲酸聚异戊二烯焦磷酸转移酶(UbiA),此酶为膜结合蛋白,是生物辅酶Q10合成的限速步骤[12]。过量表达UbiA等相关基因可以使辅酶Q10的产量提高。
　　 运用基因工程原理进行育种选育高产菌株可以获得较好的效果,但是由于辅酶Q10代谢合成路径复杂,所涉及到的基因繁多,研究工作较为缓慢,因此,还需要进一步的深入研究。
　　3展望
　　 随着辅酶Q10的需求量不断攀升,越来越多国内外学者加入到研究辅酶Q10的行列。国外学者在利用基因工程改造菌种方面以及发酵过程中的条件控制方面做了许多研究。国内的研究主要侧重于利用传统的诱变育种进行菌种选育以及配方优化方面,尽管获得了一系列产量提高的突变株,但总体产量水平还达不到工业化生产的水平。随着辅酶Q10生物合成途径及调控机制的深入研究,应用代谢工程的方法选育高产菌株,构建工程菌株,改造原菌株,从而进一步化化生产工艺。同时,辅酶Q10发酵过程中的工艺参数控制相对复杂,如何简化发酵工艺控制的中间环节,建立自动化控制模式也是十分重要的。
　　
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