激光诱导脉络膜新生血管模型的光学相干断层扫描检查

来源:用户上传      作者: 黄　焱　徐国兴　彭亦如

　　【摘要】 目的探讨鉴定脉络膜新生血管（choroidal neovascularization CNV）模型的一种客观可靠的方法。方法在间接检眼镜下用氩激光光凝有色家兔视网膜，分别于光凝后7、14、21、28天时行视网膜光学相干断层扫描（optical coherence tomography, OCT）和荧光血管造影（FFA），并做组织学检查。结果光凝后7、14天时，OCT 检查见光凝斑视网膜变薄，脉络膜反射被遮蔽，FFA未见荧光渗漏，光镜检查见视网膜神经层变薄。光凝21天后，OCT 检查见光凝斑视网膜色素上皮(RPE)层和脉络膜毛细血管层反射光带增厚，光凝后21和28天时，FFA检查分别有55%和35%的光斑有点状荧光渗漏，光镜检查有脉络膜新生血管形成。 结论OCT检查与FFA及组织学检查结果相符合，OCT及FFA检查可作为鉴定是否有CNV形成的客观可靠的方法。
　　【关键词】 新生血管 光学相干断层扫描 荧光血管造影 氩激光
　　
　　脉络膜新生血管（CNV）可见于老年性黄斑变性、病理性近视、中心性渗出性脉络膜视网膜炎、外伤、肿瘤、血管样条纹症等多种疾病，且多位于黄斑区，甚至在中心凹下，严重影响视力，目前尚无特效治疗，且易复发,因此探索CNV的发病机制与治疗手段正成为国内外研究的热点。而制作出合适的CNV动物模型是CNV的发病机制与治疗研究的主要途径，本研究拟寻找客观可靠的方法对激光诱导的兔眼CNV是否形成进行鉴定。
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 动物:色素兔16只(32只眼),体重2.0～2.5kg,雌雄不限,由福建医科大学实验动物中心提供,实验前双眼前后段检查均正常。每只兔随机取一侧眼为实验眼,另侧眼为对照眼。
　　1.2 试剂:10%荧光素钠注射液(广西梧州制药股份有限公司产品)。仪器:氩激光机(德国Zeiss公司产品)；间接检眼镜； 荧光素眼底血管造影摄像机(日本Canon公司产品)；第三代光学相干断层扫描仪(OCT3德国Zeiss公司产品)。
　　1.3 激光造模 色素兔经耳缘静脉注射2%戊巴比妥钠30mg・kg-1麻醉,双眼滴用复方托吡卡胺滴眼液2-3次,充分散瞳后拍摄实验前眼底彩照, 经激光间接检眼镜（LIO）用氩激光(波长为514nm)在兔视盘下视网膜区域内光凝20个点,激光功率为0.8W,光斑直径为100μm和曝光时间100ms,每两个激光点之间距离约为1～1.5个光斑直径。
　　1.4 检查方法
　　1.4.1 OCT 光凝后兔子分笼喂养，于光凝后1、2、3、4周分别从中随机取4只兔麻醉后散瞳,实验眼行视网膜光凝区水平和垂直线扫6条, 扫描线长5.0mm,对照眼相应视网膜区对比检查。
　　1.4.2 眼底彩照、FFA眼底照相后兔耳缘静脉内注射10%荧光素钠(0.1ml・kg-1)行FFA检查。
　　1.4.3 光镜 兔检查完后，耳缘静脉内注入过量麻醉药致死,立即摘取眼球,去除眼前节及玻璃体,将后极部眼球壁光凝区剪成5mm×5mm大小,经固定、脱水、透明、包埋后连续切片(4μm厚),HE染色后于光镜下观察。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1眼底镜观察及FFA在进行光凝时，视网膜随着激光能量密度的增加由灰白色到乳白色斑，边界不清，光斑中央有气泡形成是bruch膜破裂的标志。光凝后2天，视网膜水肿，隆起。光凝后1周，视网膜水肿减轻，光斑边界不规则，光斑中央少量色素沉着。光凝后2周，视网膜水肿不明显，光斑中央色素增加。光凝4周，视网膜无水肿，光斑表面渐形成土黄色瘢痕(图1)。
　　CNV 的FFA阅片标准[1]：在造影早期即显影；与视网膜血管系统没有联系；荧光素迅速渗漏,有一定的积存范围,后期形成高荧光区。光凝后1、2周时， FFA未见荧光渗漏(图2)，光凝后3、4周时，分别有55%和35%的光斑出现荧光渗漏,晚期呈现高荧光(图3)
　　2.2 OCT 对照眼OCT表现为正常的视网膜和脉络膜结构(图4)。光凝后第1周视网膜神经上皮层略增厚,可见轻度的层间水肿,第2周水肿减轻, OCT 检查见光凝斑视网膜变薄，视网膜色素上皮层增厚，脉络膜反射被遮蔽(图5)，视网膜神经上皮层厚度恢复正常,以后变化不明显；光凝后第4周可见视网膜色素上皮细胞层断裂,可见典型的CNV,表现为视网膜神经上皮下的团块状、梭形或不规则膨大(图6)。
　　2.3光镜观察 正常有色家兔视网膜脉络膜各层组织结构清晰、完整(图7) 。光凝后1 周,光镜下可见RPE层、Bruch 膜皱缩断裂、外核层缺损、内核层部分消失、脉络膜毛细血管损伤、色素脱失,可见到色素性巨噬细胞和迁移增殖的RPE细胞。光凝后3 周, 并有毛细血管样物质突向视网膜下形成早期的CNV(图8), 光凝后4周, 视网膜水肿消退,可见新生血管突破色素上皮;新生血管膜明显增厚(图9) 视网膜内层变薄，向上隆起，内、外颗粒层、外丛状层细胞层结构混乱，节细胞减少，排列不规则。
　　
　　3 讨论
　　
　　目前用于激光诱导的CNV 模型动物有猕猴、猪、BN 大鼠、色素兔等,各种属各有其优缺点。猴的CNV 模型与人类疾病改变极为相似[2],并且光镜、电镜下组织学改变一致,眼底荧光血管造影中还具有渗漏荧光素的特征,新生血管的发生率达30 %～40 % ,这种新生血管一般发生在激光光凝后4 周,持续2～52周。但因动物来源和试验难度大,应用较少。BN 大鼠成模率较高,可达76 % ,成模时间短(21天稳定) ,是一种较好的模型[3],但动物眼球较小,操作相对难度大,不便于活体的直接眼底观察,动物来源也并不广泛。我们采用有色健康家兔建立模型,其视网膜结构和色素成分与人相似,其光凝斑的CNV 发生率较高[4,5], 并且动物来源广泛、廉价,眼球大小接近于人,便于操作和观察。通过直接眼底观察到光斑从损伤、水肿、渗出到修复过程的眼底改变。FFA 证实从光凝后3周开始就出现了较明显的动脉早期的高荧光渗漏,该渗漏与视网膜血管系统没有联系,同期的组织学观察见到了光镜下可见由单层血管上皮细胞围成的早期CNV的结构改变。组织学切片是目前CNV的鉴别和确定主要方法之一。通过本实验的组织学观察发现，激光光凝后，前7天光凝区光斑为一种急性损伤性反应，并无新生血管的形成，3周后，光斑附近发现了CNV，随机选取光凝点行组织切片检查显示CNV发生率在3、4 周分别为55%和35%。从上不难看出，新生血管发生的高峰期是光凝后21天，这与分布于光斑内及周围的血管内皮细胞、巨噬细胞分泌表达的血管生长因子及受体大多在这一时间段相关。
　　OCT是近年眼底病临床应用较为广泛的一种非接触式、非侵入性影像诊断技术，与荧光素眼底血管造影等检查相比较，能更直观的显示CNV的形态并准确测量其大小和厚薄，因而对诊断CNV有其独特的优越性。它利用光干涉原理能清晰显示视网膜不同层次的结构,本实验使用的zeiss第三代OCT能获得10μm高分辨率图像，它在CNV 诊断中的作用已得到国内外学者的肯定。本实验在组织学和FFA检查的同时进行OCT扫描，他们对荧光渗漏、是否有CNV形成的结果是一致的。 王凯[6]认为OCT能反映出CNV与RPE之间的关系,OCT对于CNV与周围组织的关系的分辨要优于FFA,如果OCT图像上CNV边界清晰,与周围组织粘连不紧密,可以预测手术操作会相对简单且手术后视力恢复会较好，测量CNV直径对治疗也有指导意义。如果经典型CNV的成分超过50%,将测量中得到的最大CNV直径再加1mm作为光动力治疗时采用的光斑大小是一个合理的选择。本课题将对CNV模型进行进一步的PDT治疗研究，因此，仅仅有FFA的检查是不够的，更无法进行组织学的鉴定，做OCT扫描是最好的诊断依据，同时对后面的治疗有重要的指导意义。兔子视网膜没有黄斑，我们直接对光凝斑进行OCT检查。骆荣江[7]等认为兔子视网膜OCT检查与组织学检查相符合。本试验发现，色素兔视网膜取材时，光凝斑清晰可见，包埋时定位非常准确，这样保证了OCT检查所见的视网膜部位与光镜所见保持一致。因此，在临床上，患者无法作组织学检查时，OCT检查如有CNV的典型表现，应该可以作为诊断的重要依据。

　　综上所述，用氩激光光凝3周后，可形成兔眼CNV模型，准确判断造模是否成功是决定下一步研究是否有意义的关键所在，OCT是客观可靠的简便的检查方法，对视网膜没有损伤，能指导下一步的治疗研究，如果能结合FFA观察当然更能明确诊断。
　　
　　参考文献
　　〔1〕 白建伟,惠延年.实验性视网膜下新生血管的荧光造影与眼底病理改变的相关性及意义[J] ..第四军医大学学报,2000,21(3):388
　　〔2〕Krzystolik MG,Afshari MA. Adamis AP ,et al. Prevention of experimental choroidal neovascularization with intravitreal anti - vascular endothelial growth factor antibody fragment [J] .Arch Ophthalmol ,2002 ;120(3) :338 - 346.
　　〔3〕 Kamizuru H , Kimura H , Yasukawa T ,et al. Monoclonal antibody - mediated drug targeting to choroidal neovascularization in the rat [J ] . Invest Ophthalmol Vis Sci ,2001 ; 42 (11) :2664 - 2672.
　　〔4〕 G.G. Gum, C.G. Wong R.P. de Carvalho. Laser-Induced Models of Choroidal Neovascularization in Rabbits Associated With Sustained Suprachoroidal and Episcleral Delivery of VEGF and bFGF[J].Invest Ophthalmol Vis. Sci., May 2005; 46: 1422.
　　〔5〕乔岗, 周希瑗, 张孝明, 等.实验性兔脉络膜新生血管模型研究[J] . 重庆医科大学学报,2005,30(2):216-219
　　〔6〕王凯，姜燕荣，黎晓新，等.引起黄斑下脉络膜新生血管的几种常见疾病的光相干断层扫描图像特征分析[J] .中华眼底病杂志，2005，21（2）：69-73
　　〔7〕骆荣江，葛坚，郭彦，等.兔眼视网膜厚度的光学相干断层扫描测量与组织学检查的相关性研究[J] .中华眼底病杂志2000，16（2）111-113
　　
　　注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文”

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