miR—145通过下调靶基因ACVR1B促进急性川崎病的病理进程

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　　[摘要] 目的 探討miR-145下调靶基因ACVR1B促进急性川崎病（KD）的病理进程。 方法 回顾性分析宜昌市第一人民医院2015年11月～2018年6月收治的108例KD患儿的病历资料，根据病情将其分为4组，KD急性组为确诊的KD急性期患儿28例，KD康复组为同期入院进行治疗后康复期的儿童24例，发热对照组为急性上呼吸道感染的发热患儿30例，正常对照组为同期健康体检者26名。分别抽取其血清检查miR-145的表达水平。进行靶基因数据库、荧光素酶报告基因法、qRT-PCR及Western blot等相关检验。 结果 KD急性组白细胞计数、C反应蛋白和红细胞沉降率均显著高于正常对照组（P < 0.05）；KD急性组血清miR-145水平显著高于KD康复组、发热对照组及正常对照组（P < 0.05）；发热对照组血清中ACVR1B mRNA的表达水平显著低于正常对照组（P < 0.05）；KD急性组血清中ACVR1B mRNA表达水平显著低于正常对照组、发热对照组和KD康复组（P < 0.05）。结论 miR-145可以结合ACVR1B的3′-UTR并抑制ACVR1B的表达，两者的调控关系能促进急性KD的病理发展。
　　[关键词] miR-145；川崎病；靶基因ACVR1B；冠状动脉内皮细胞
　　[中图分类号] R725.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）04（c）-0013-05
　　miR-145 promotes the pathological process of acute Kawasaki disease by downregulating the target gene ACVR1B
　　LYU Dianyi WU Fuxia CHEN Fengyi
　　Department of Pediatrics， Yichang First People′s Hospital， Hubei Province， Yichang 443000， China
　　[Abstract] Objective To investigate the effect of down-regulation of ACVR1B gene by miR-145 in promoting the pathological process of acute Kawasaki disease （KD）. Methods A total of 108 children who were treated in Yichang First People′s Hospital from November 2015 to June 2018 were included in the retrospective analysis， according to the disease conditions， children were divided into acute KD group （n = 28）， with a confirmed diagnosis of acute KD； KD recovery group （n = 24）， who was admitted to the hospital during the same period and in the recovery stage after treatment； pyrexia control group （n = 30）， who had pyrexia due to upper respiratory tract infection； and normal control group （n = 26）， who underwent physical examination during the same period. Serum was taken from the patients to check the expression level of miR-145. Target gene database was searched， and chemical-activated luciferase gene expression， qRT-PCR， and Western blot were performed. Results The white blood cell count， C-reactive protein， and erythrocyte sedimentation rate of acute KD group were significantly higher than the normal control group （P < 0.05）， the acute KD group had significantly higher expression of miR-145 in serum than the KD recovery group， the pyrexia control group， and the normal control group （P < 0.05）. The expression level of ACVR1B mRNA in serum of the fever control group was significantly lower than that of the normal control group （P < 0.05）. The expression level of ACVR1B mRNA in serum of the acute KD group was significantly lower than that of the normal control group， the fever control group and the KD rehabilitation group （P < 0.05）. Conclusion miR-145 can bind the 3′-UTR of ACVR1B and inhibit the expression of ACVR1B， and the regulatory relationship between miR-145 and ACVR1B can promote the pathological development of acute KD. 　　[Key words] miR-145； Kawasaki disease； Target gene ACVR1B； Coronary endothelial cells
　　川崎病（Kawasaki disease，KD）是一种常见的儿童自身免疫性血管炎综合征，并发冠状动脉瘤（CAA）和冠脉狭窄是青壮年猝死和心肌梗死发生的重要原因[1-2]。根据近期的研究显示，儿童KD是成人缺血性心脏病发生的新增危险因素。目前，KD已取代风湿热成为儿童后天性心脏病的主要原因[3]。虽然静脉输注丙种球蛋白（IVIG）和阿斯匹林联合治疗方案广泛应用后，KD死亡率和冠状动脉并发症发生率明显下降，但近年来发现IVIG治疗耐药病例增多，迄今病因及发病机制未明。因此，深入研究KD及其冠状动脉损害发生发展的相关机制，做好预防工作，做到早发现、早治疗将非常有助于降低KD及其冠状动脉损害发病率及死亡率[4-5]。
　　本文通過研究miR-145及其靶基因对冠状动脉内皮细胞（HCAEC）功能影响，从而为明确miR-145及靶基因ACVR1B在KD冠状动脉损害中可能的分子机制奠定基础，所以深入研究miRNA与KD的关系，对认识KD的发生和演进、临床诊断与治疗有十分重要的意义。
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料
　　回顾性分析宜昌市第一人民医院（以下简称“我院）2015年11月～2018年6月收治的108例患儿的病历资料。根据病情状况分为四组：KD急性组，我院收治的确诊的KD急性期患儿28例；KD康复组，同期入住我院进治疗后康复期的儿童24例，选择未发现器质性疾病且血液相关实验室检查无异常及年龄、性别与KD患儿相匹配的儿童；正常对照组血标本采集来自同期我院健康体检儿童26名，选择未发现器质性疾病且血液相关实验室检查无异常及年龄、性别与KD患儿相匹配的儿童；发热对照组血标本采集自同期本医院急性上呼吸道感染的发热患儿30例，选择未发现器质性疾病且血液相关实验室检查无异常及年龄、性别与KD患儿相匹配的儿童。四组儿童的性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。见表1。
　　1.2 方法
　　1.2.1 血清采集 抽取所有对象的清晨空腹外周静脉血：采用一次性血清分离胶管，抽取外周静脉血约3 mL；待血清析出后以1000 g离心10 min，取上层血清保存至-80℃冰箱待检测[6]。
　　1.2.2 qRT-PCR检测血清miR-145和ACVR1B的表达 取0.5 mL血清标本，采用Trizol法提取血清总RNA，实验步骤按照Trizol试剂盒说明书进行。将提取到的总RNA按照反转录试剂盒的说明书进行RNA逆转录，合成cDNA。按照qRT-PCR试剂盒说明书进行进行PCR反应。
　　1.2.3 细胞培养 取急性KD合并冠脉并发症患儿的冠状动脉组织标本，0.25%胰蛋白酶消化，待细胞分散后，过滤收集HCAEC细胞。取HCAEC细胞，在含10%胎牛血清的培养基中于37℃，5%的CO2的培养箱中常规培养，再用2.5%的胰蛋白酶每2天进行消化，传代，并取对数生长期细胞用于实验。
　　1.2.4 细胞转染 取对数生长期HCAEC细胞（1～1.5）×106个分板，接种于6孔板中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养至细胞密度60%～70%时，将细胞分为3组：miR-145 mimics转染组，转染miR-145 mimics；miR-145 mimics+ACVR1B转染组，转染miR-145 mimics和ACVR1B；对照组，转染negative control miRNA mimics （miR-NC）。将培养基换为无血清无双抗的培养基，每孔1 mL，miRNA及转染试剂Lipofectamine 2000分别用100 μL OMEM稀释后，依照说明书所需比例混匀后静置20 min后，逐滴加入并且轻晃混匀，培养6 h后，再换为含完全培养基，待48 h后收集细胞进行下一步分析。
　　1.2.5 荧光素酶报告基因法检测miR-145与靶基因ACVR1B的结合 通过microRNA靶基因数据库进行筛选，预测ACVR1B为miR-145的潜在靶基因（图1）。构建ACVR1B野生型3′-UTR荧光素酶报告基因质粒pMIR-ACVR1B-wt，并以pMIR-ACVR1B-wt质粒为模板，利用PCR搭桥法（overlapping PCR）构建其潜在结合位点突变型报告基因质粒pMIR-ACVR1B-Mut。将miR-145 mimics，negative control miRNA mimics（miR-NC）内参海肾荧光素酶以及pMIR-ACVR1B-wt和pMIR-ACVR1B-Mut报告基因质粒共转染进HCAEC细胞中，在细胞培养箱中培养36 h后收取细胞液，使用双荧光素酶报告基因试剂盒测定荧光素酶活性。
　　1.2.6 Western blot 采用含50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4），150 mmonl/L NaCl，0.5%脱氧胆酸钠，0.1% SDS和蛋白酶抑制剂及1 mmonl/L苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液分离蛋白质。通过SDS-PAGE凝胶进行电泳，按说明书进行Western blot实验。
　　1.2.7 CCK8检测细胞增殖 取对数生长期HCAEC细胞，以1×105/mL接种于96孔培养板，每孔培养基200 μL，每组6个复孔。在37℃条件下培养，进过48 h后每孔加入200 μL CCK-8持续培养2 h。使用酶标仪检测各孔在450 nm处吸光度数值。
　　1.2.8 流式细胞法检测细胞周期 悬浮并收集不同时间点细胞，生理盐水冲洗细胞两遍，70%乙醇固定细胞。加入碘化丙啶DNA荧光染色（propidium iodide，PI：50 mg/L，1% Triton X-100），4℃冰箱避光染色30 min，铜网过滤，使样本成为合格的单细胞悬液，流式细胞仪检测细胞周期[7]。 　　1.2.9 Transwell迁移实验检测细胞迁移能力 采用24孔Transwell小室检测细胞的迁移能力，在下层小室加入含10% FBS的RPMI1640完全培养基，在上层小室加入处于对数生长期HCAEC细胞，将Transwell小室置37℃，5%CO2孵箱培养，24 h后，取出侵袭小室，用甲醇固定20 min，采用结晶紫染色，在显微镜下观察并计数贴在滤膜反面的所有细胞，选取代表性视野拍照。实验重复3次。
　　1.3 统计学方法
　　采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，方差非齐性的两组比较采用非参数检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；采用Pearson进行相关性分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 miR-145、ACVR1B在KD患儿血清中的表达关系
　　KD急性组患儿的WBC、CRP和ECP均高于正常对照组（均P < 0.05），见表2。qRT-PCR检测结果显示：KD急性组血清中miR-145较KD康复组、发热对照组、正常对照组显著升高（均P < 0.05），见图2。KD康复组与正常对照组血清中ACVR1B mRNA的表达水平比较差异无统计学意义（P > 0.05）；与正常对照组比较，发热对照组血清中ACVR1B mRNA的表达水平显著降低（P < 0.05）；KD急性组血清中ACVR1B mRNA表达水平显著低于正常对照组、发热对照组和KD康复组（P < 0.05），见图3。
　　2.2 miR-145的靶基因及相关靶向调控关系检测
　　双荧光素酶检测结果显示，miR-145 mimics组的pMIR-ACVR1B-wt质粒荧光素酶活性明显低于miR-NC组，差异有统计学意义（P < 0.05）；而两组的pMIR-ACVR1B-Mut荧光素酶活性差异无统计学意义（P > 0.05）。说明miR-145 mimics可显著抑制pMIR-ACVR1B-wt质粒荧光素酶活性；而对pMIR-ACVR1B-Mut荧光素酶活性无明显影响（图4A）。为进一步验证miR-145对ACVR1B的调控作用，qRT-PCR检测结果发现，miR-145 mimics转染组中ACVR1B的mRNA表达水平显著低于对照组（图4B）；Western blot检测结果显示，miR-145 mimics转染组ACVR1B蛋白表达灰度值为（0.86±0.05），明显高于miR-NC组ACVR1B蛋白表达灰度值（0.41±0.03），差异有统计学意义（P < 0.05）。可见，相比对照组，miR-145 mimics转染组中ACVR1B蛋白表达水平显著降低（图4C）。
　　2.3 miR-145与ACVR1B调控HCAEC细胞增殖、迁移及周期的相关影响
　　CCK8实验结果显示，miR-145 mimics转染组的OD值显著高于对照组（miR-NC）（P < 0.05），而miR-145 mimics+ACVR1B转染组的OD值显著低于miR-145 mimics转染组（P < 0.05），见图5A。流式细胞法检测结果显示，miR-145 mimics转染组S期细胞比值显著高于对照组（P < 0.05），而miR-145 mimics+ACVR1B转染组S期细胞比值显著低于miR-145 mimics转染组（P < 0.05），见图5B。Tranwell迁移实验显示，miR-145 mimics转染组细胞迁移效果显著高于对照组（P < 0.05），而miR-145 mimics+ACVR1B转染组细胞迁移效果显著低于miR-145 mimics转染组（P < 0.05），见图4C。
　　3 讨论
　　KD是一种以全身血管炎为主要病变的急性发热出疹性疾病，在欧美等发达国家KD已取代风湿热成为儿童后天获得性心脏病的首位病因。KD急性期各种免疫细胞被激活，从而促进多种炎症因子基因的表达，而T细胞介导的异常免疫应答及细胞因子的级联放大效应导致血管内皮功能障碍是KD血管炎性损伤的基础[8-9]。
　　miRNA是一类长约22nt的非编码单链RNA分子，其可通过与靶mRNA结合抑制靶mRNA的剪切或翻译[10]。miRNA对基因表达的调控作用涉及到生物体生长发育的诸多过程，包括发育时序的控制，细胞的生长、分化、增殖、凋亡等，其在致病机制的研究、疾病的诊断和治疗方面的重要性越来越受到人们的关注[11-14]。既往研究发现，多种miRNA与炎症细胞分化发育、炎性因子的调控、血管炎性损害相关[15]。miRNA可以反映心脏和血管对损伤的易感性及哺乳动物对于持久心血管功能的依赖性[16]。一项对心血管疾病小鼠模型和人类活检标本miRNA的分析结果表明，miRNA的标记模式可用于诊断多种心血管疾病，包括心力衰竭、心肌梗死局部缺血等[17]。本研究使用qRT-PCR检测发现，KD急性组血清中miR-145表达水平较KD康复组、发热对照组、正常对照组显著升高，提示miR-145对急性KD有促进作用。
　　TGF-β超家族成员通过参与细胞增殖、分化、黏附、迁移、凋亡等过程，在维持机体稳定方面起着至关重要的作用[18]，TGF-βⅠ型受体又称激活素受体类似激酶（ALK），是TGF-β信号通路的核心分子。研究表明，TGF-β信号通路最主要的作用是抑制细胞生长[19]。TGF-βⅠ型受体与不同的TGF-βⅡ型受体结合可介导不同配体产生不同信号，有研究表示TGF-β不仅能与ALK5结合还能与ALKl结合，AMH能与ALK2、ALK6结合[20]。ACVR1B是一种TGF-βⅠ型受体，但ACVR1B基因与急性KD相关性研究未见报道，所以深入研究靶基因ACVR1B在急性KD中的影响，将为理解KD的发生发展及寻找KD治疗性靶标提供理论线索与实验依据。本研究结果显示，KD急性组血清中ACVR1B的mRNA和蛋白表达水平显著低于正常对照组、发热对照组和KD康复组，提示miR-145對急性KD有抑制作用。 　　本研究结果还显示，miR-145 mimics可显著抑制pMIR-ACVR1B-wt质粒荧光素酶活性；而对pMIR-ACVR1B-Mut荧光素酶活性无明显影响。提示miR-145可以通过结合ACVR1B的3′-UTR进而抑制ACVR1B的表达。miR-145 mimics转染组的OD值、S期细胞比值、细胞迁移能力显著高于对照组（P < 0.05），miR-145 mimics+ACVR1B转染组的OD值、S期细胞比值、细胞迁移能力显著低于miR-145 mimics转染组（P < 0.05），提示miR-145可促进急性KD HUVEC细胞增殖，迁移和细胞周期在S期聚集，但这种促进效果会被ACVR1B过表达逆转。
　　综上所述，miR-145可促进急性KD的冠状动脉内皮细胞增殖、迁移及周期在S期的聚集，而这些抑制效果可被ACVR1B抑制及补回，而miR-145可以结合ACVR1B的3′-UTR并抑制ACVR1B的表达，促进急性KD的发展。因此，miR-145及ACVR1B可能成为急性KD诊断及治疗的新靶点。
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　　（收稿日期：2018-08-07 本文编辑：任 念）
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