来氟米特长效注射剂的制备方法

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　　摘 要 目的：以poloxamer P407和P188为凝胶基质，制备一种适宜皮下注射的长效缓释制剂。方法：以胶凝温度、黏度和溶蚀速率为指标，采用Box-Behnken响应面法优选原位凝胶配方。结果：根据拟合结果使用poloxamer P407和P188分别为21.63%和2.41%时，胶凝温度为34.99 ℃、黏度48.07 cP、溶蚀时间4.47 h，结合固体分散体技术得到释放平稳、7 d累积释放率可达80%以上的皮下原位凝胶注射剂。结论：该模型具有高度显著性，优选处方可以满足长效缓释注射剂的要求。
　　关键词 poloxamer 原位凝胶 溶蚀 Box-Behnken响应面法
　　中图分类号：R944.1； R979.5 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2019）11-0061-05
　　Preparation of leflunomide long-term release injection
　　XIE Song*
　　（Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）
　　ABSTRACT Objective： To prepare a long-term release subcutaneous injection based on poloxamer P407 and P188. Methods： The gelation temperature， viscosity and dissolution rate were taken as dependent variables and the Box-Behnken response surface method was used to optimize the in situ gel formulation. Results： According to the fitting results， when poloxamer P407 and P188 were used at 21.63% and 2.41%， the gelatinization temperature was at 34.99 ℃， the viscosity was 48.07 cP， and the dissolution time was 4.47 h. Combined with solid dispersion technology， the in situ gel injection has it stable release rate for 7 days， and finally obtained more than 80% accumulative release. Conclusion： The model was highly significant. The optimized formulation can meet the requirements of long-term release injection.
　　KEY WORDS poloxamer； in situ gel； dissolution； Box-Behnken response surface method
　　类风湿性关节炎（RA）属于自身免疫性疾病。是一种发病缓慢、伴随炎症的关节疾病，多发于四肢关节[1]。来氟米特是一种免疫调节剂，通常用于治疗RA，其结构为异噁唑类，通过化学合成而得。该药在国内外已上市多年，为口服固体制剂。其代谢产物特立氟胺有两个作用：一是通过抑制二氢乳清酸脱氢酶的活性从而阻断嘧啶的从头合成途径，影响DNA和RNA的合成；二是可抑制酪氨酸激酶的活性和细胞的粘附，并能抑制抗体的产生和分泌[2]。该药临床应用兼具良好的安全性和有效性。
　　以泊洛沙姆（poloxamer）为基质制备的原位凝胶属温度敏感型。其不同比例的溶液在感受温度变化时会产生溶胶-凝胶之间的可逆转变。又因非毒性和溶液稳定性，使其非常适合作为注射剂的载体[3]。本研究通过Box-Behnken响应面法优选满足皮下注射要求的原位凝胶配方，同时采用固体分散体技术调节释药速率从而达到小剂量来氟米特局部给药一周一次的目的。
　　1 材料与方法
　　1.1 仪器
　　UV-1700紫外分光光度计（岛津仪器（苏州）有限公司）；RV10旋转蒸发仪（艾卡（广州）仪器设备有限公司）；SHA-B数显恒温水浴振荡器（常州国华电气有限公司）；DV-Ⅲ旋转式黏度计（美国博勒飞公司）；CP-225D型电子天平（德国赛多利斯集团）。
　　1.2 试药
　　来氟米特（南京康满林化工实业有限公司，批号20160301）；乙基纤维素（泸州北方化学工业有限公司，批号20160403）；poloxamer P407（批号WPWJ554C）、poloxamer P188（批号WPYJ540B）均购自巴斯夫（中国）有限公司；甲醇、乙醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）。
　　1.3 方法
　　1.3.1 空白凝胶配方优选
　　1）空白凝胶的制备 应用冷溶法[4]，按处方量量取纯化水，冷藏过夜，取处方比例P407和P188缓慢加入上述冷水中，冷藏至完全溶解，备用。
　　2）凝胶优选配方评价指标 鉴于项目开发目的是对患处进行局部注射并达到迅速胶凝、长效缓释的目的。故选用胶凝温度（25 ℃）、黏度和溶蚀速度为评价指标。
　　3）胶凝温度及黏度测定方法[5] 取空白凝胶液20 ml置于Brookfield旋转黏度计测试杯中，选取18号转子，设定转速100 r/min，溫控程序为4～40 ℃，升温速率0.5 ℃/min，黏度突然上升时的拐点温度即为胶凝温度，取25 ℃时的黏度为凝胶黏度。 　　4）溶蚀速率测定方法[6] 取空白凝胶液5 ml于玻璃试管中，称重，置于调整到适宜胶凝温度的恒温水浴振荡器中使之完全胶凝，加入与凝胶相同温度保温的pH 7.0磷酸盐缓冲溶液（PBS）3 ml，振荡，设定频率为50 Hz，计时，间隔30 min取出将PBS全部倾出，称取剩余凝胶重量，补加等量的保温PBS，至累积溶蚀量>95%止。减失重量即为溶蚀量。
　　5）Box-Behnken响应面设计法 以P407和P188含量为响应面分析法的因素[7-8]，分别按-a、-1、0、1、a5水平进行编码（a取值为1.414），以凝胶温度、黏度和溶蚀速率为评价指标，进行试验设计（表1、2）。
　　1.3.2 来氟米特固体分散体的制备
　　预试验发现用优化的空白凝胶配方载药体外释放时间达不到预期的7 d，为了减缓释药速率，考虑使用水难溶性固体分散体技术对原料进行预处理。
　　采用溶剂法制备来氟米特固体分散体[9]，称取乙基纤维素（EC）12 g，溶解于240 ml乙醇中，再加入4 g来氟米特，超声使溶解。从5% EC-来氟米特溶液中回收乙醇、将残余物真空干燥，得来氟米特固体分散体。
　　1.3.3 载药凝胶制备
　　1.3.3.1 体外释放测定方法
　　按配方制备空白凝胶，冷藏备用。取称取来氟米特置于上述空白凝胶中，混合均匀，制成3 mg/ml载药凝胶。取上述载药凝胶5 ml置于37 ℃恒温水浴振荡器中使之完全胶凝，然后加入37 ℃ PBS 3 ml，开启振荡，频率50 Hz，并开始计时，固定间隔时间取样。取样时将PBS全部倾出容器中，补加等量的37 ℃ PBS。从取出的溶液中移取1 ml置于25 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，UV测定来氟米特含量。
　　1.3.3.2 载药凝胶含量测定方法
　　1）来氟米特甲醇溶液紫外吸收特征的确定 精密称取来氟米特1 mg，置于100 ml容量瓶中，加甲醇溶液溶解，定容，摇匀，得浓度10 mg/ml来氟米特溶液。以甲醇溶液为空白对照，按紫外-可见分光光度法在190～400 nm波长范围内进行扫描，确定其在甲醇中的最大吸收波长。
　　2）标准溶液的配制 精密称取来氟米特5.47 mg，置于100 ml容量瓶中，加甲醇溶液溶解，定容，摇匀，得浓度54.7 mg/ml的储备液。分别移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、0.9、1.0、1.6、2.0、2.5 ml储备液于10 ml容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，得浓度分别为0.547、1.094、2.188、3.282、4.376、4.923、5.47、8.752、10.94、13.675 mg/ml的溶液。
　　3）标准曲线的绘制 以甲醇溶液为空白对照，于波长260 nm处测定不同浓度标准溶液的吸光度。以吸光度对浓度（mg/ml）作线性回归，当浓度为0.547～13.675 mg/ml时得来氟米特于甲醇溶液中的回归方程y=0.068x+0.005 4，R2=0.999 0。
　　2 结果
　　2.1 响应面设计法拟合结果分析
　　使用Design expert 8.0.5b对试验数据运行处理。方差分析结果显示，模型具有高度的显著性，且失拟项不显著，对于胶凝温度和黏度拟合度较好，溶蚀时间拟合度稍差（表3）。
　　对应的等高线图和3D效应面图见图1、2。
　　1）优化 以上述模型为基础，设定胶凝温度35℃、黏度<100 cP、溶蚀时间最大化，经design expert 8.05b 运行优化，得结果为：当A=0.46，B=-1，即P407 21.63%，P188 2.41%时，胶凝温度为34.99 ℃、黏度48.07 cP、溶蚀时间4.47 h，可信度88.36%。
　　2）验证 根据优化结果进行三次重复验证试验，同时选取实验序号2、11为参照。结果见表4。
　　结果显示：①虽然对照实验11#溶蚀速率最慢（图3），但凝胶黏度大不利于注射（图4）；②优化方案实验结果与设计比较接近，在室温环境中黏度小于100 cP利于注射时的吸液和推注，在进入皮下后能迅速胶凝。
　　2.2 来氟米特固体分散体含测及差示扫描量热法（DSC）鉴定结果
　　采用上述紫外法测定来氟米特固体分散体含量结果为103.8%，DSC检验结果显示来氟米特与EC两者完全熔合（图5）。
　　2.3 载药凝胶体外释放实验结果
　　取制备好的来氟米特固体分散体适量，配制成3 mg/ml载药凝胶20 ml，按体外释放测定方法和载药凝胶含量测定方法测定含量。
　　结果显示，使用固体分散体技术可以显著降低药物释放速率，7 d累積释放达到80%，呈线性（y=11.248x-11.978，R2=0.998 7），满足来氟米特一周给药一次的临床要求。
　　3 讨论
　　温敏型原位凝胶是一种新的药物装载和释放系统。在储存时低黏度的液体，给药后可迅速在给药部位形成固态的凝胶[10]，相比于口服固体制剂具有制备工艺简单、药物分散均匀、给药方便可实现缓释的优点[11]。
　　Box-Behnken试验设计常用于在确信试验因素对试验指标存在非线性影响时对因素与指标间的关系进行试验分析，尤其是在要求试验的各因素不能同时在高水平设置下进行试验时。本试验基于：①人体基础体温37 ℃，又需皮下注射的特点，设计评价指标分别是胶凝温度35℃[12]，胶凝温度太高可能注射后不能迅速形成原位凝胶、胶凝温度太低可能在夏季室温比较高的情况下在注射前即产生胶凝。②注射剂一般要求注射液能通过常规针头吸液并推注时阻力不易过大，因而设计黏度小于100 cP，考虑载药后黏度会增加，因此优化后的空白凝胶黏度为50 cP，载药后黏度为67 cP，吸液和推注都比较方便，同时也为今后提高载药量预留空间。③优选配方溶蚀速率稳定在10%左右，显示固体分散体结合原位凝胶技术可以达到调控药物释放的目的，实现长效缓释。后续拟进行动物体内药代试验，根据结果可通过调整EC与来氟米特比例调节释放度。
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