艾滋病患者HIV-1抗原特异性CD8+记忆性母细胞样T细胞的扩增

来源:用户上传      作者:

　　【摘要】 目的 对艾滋病患者人类免疫缺陷病毒-1型（HIV-1）抗原特异性CD8+记忆性母细胞样T细胞（TSCM）的扩增进行分析。方法 纳入10例HIV-1感染者作为研究对象， 磁珠法分离艾滋病患者CD8+T淋巴细胞， 并利用Tetramer-SL9标记T细胞表面抗原受体。利用流式细胞术检测标记有流式抗体的HIV-1抗原特异性CD8+ TSCM的分布情况， 利用细胞因子探索其扩增。结果 HIV-1抗原特异性CD8+ TSCM在CD8+ T淋巴细胞中的比例， 随着时间延长， 可诱导出更多的TSCM细胞， 但是峰值在10 d左右。结论 艾滋病患者CD8+ T细胞中TSCM细胞的存在， 用HIV-1抗原表位（SL9）来标记安全性高， 扩增效果好， 可为艾滋病的过继免疫治疗提供技术参考。
　　【关键词】 艾滋病;CD8+ T细胞;记忆性母细胞样T细胞;抗原特异性
　　【Abstract】 Objective To analyze the amplification of human immunodeficiency virus-1 （HIV-1） antigen-specific CD8+ memory stem T cells （TSCM） in AIDS patients. Methods 10 HIV-1 patients were enrolled in this study. CD8+ T lymphocytes were isolated by magnetic bead method and T cell surface antigen receptors were labeled with Tetramer-SL9. Flow cytometry was used to detect the distribution of HIV-1 antigen-specific CD8+ TSCM labeled with flow antibody， and cytokines were used to explore its amplification. Results The proportion of HIV-1 antigen-specific CD8+ TSCM in CD8+ T lymphocyte can induce more TSCM cells with time prolonging， but the peak value was about 10 d. Conclusion The presence of TSCM cells in CD8+ T cells of AIDS patients is highly safe labeled with HIV-1 epitope （SL9）， and the amplification effect is good. So it may provide a technical reference for adoptive immunotherapy of AIDS.
　　【Key words】 AIDS; CD8+ T cells; Memory stem T cells; Antigen specificity
　　基金項目：广东省医学科学技术研究基金（项目编号：A2015047）
　　作者单位：519000 中山大学附属第五医院
　　通讯作者：洪仲思
　　艾滋病目前已成为严重的全球公共卫生问题[1]。过继免疫疗法是运用生物技术或者生物制剂， 对一定条件下患者体内免疫细胞采集、扩增后进行自体回输， 起到激发自身免疫功能的作用， 从而达到细胞治疗的目的[2]。本文旨在检测艾滋病患者体内HIV-1抗原特异性TSCM细胞的分布以及利用细胞因子进行扩增的情况。
　　1 资料及方法
　　1. 1 病例来源 选取10例艾滋病患者均来自中山大学附属第五医院感染病防治中心随访病例。
　　1. 2 试剂和仪器 人外周血淋巴细胞分离液、CD8+ T淋巴细胞阳选磁珠、RPMI-1640培养基、胎牛血清、Indo-1AMCell Permeable细胞可渗透钙离子荧光探针、流式细胞检测抗体、HLA-A*0201限制的Tetramer SL9（SLYNTATL）-PE、T cell Activation/Expansion Kit、磷酸盐缓冲溶液（PBS）[含体积分数2%的BSA和0.5%的乙二胺四乙酸（EDTA）]、2%多聚甲醛溶液、流式细胞仪（BD公司）。
　　1. 3 方法
　　1. 3. 1 外周血采集与处理 从上肢肘窝静脉取血10 ml， 至EDTA抗凝的负压采血管（BD公司）。T细胞的分离及培养均在生物安全二级实验室内进行。
　　1. 3. 2 分离CD8+ T淋巴细胞 利用淋巴细胞分离液， 采用密度梯度离心法获取外周血单个核细胞（PBMC）， 用PBS缓冲液重悬后加带有特异性单抗的磁珠， 利用磁珠分选法获取CD8+ T淋巴细胞， 置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中。
　　1. 3. 3 流式细胞仪标本制备 ①收集培养板内CD8+T细胞离心后PBS缓冲液重悬;②根据HIV-1抗原特异性TSCM细胞表位特点标记抗体：CD8-Pacific Blue、CD122-APC、CD95-FITC、CD62L-PE CY7、CCR7-Alexa Fluor、CD45RO-PercP CY5.5、CD45RA-Texas Red、indo、Tetramer-SL9-PE。避光冰浴20 min。加PBS缓冲液洗涤1次， 弃上清， 加PBS缓冲液重悬至500 μl， 移液至BD流式细胞管4℃避光保存。
　　1. 3. 4 上流式细胞仪分析 荧光抗体染色后， 用流式细胞仪分析， 并用flowjo 流式分析软件对结果进行分析。 　　1. 3. 5 扩增患者体内的抗原特异性的记忆性母细胞样T淋巴细胞 ①细胞培养：将分离出来的PBMC置于10%含胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养， 添加细胞因子（10 ng/ml Anti-CD3、10 ng/ml Anti-28， 10 ng/ml IL-2）。培养环境：体积分数5%CO2、饱和湿度及37℃下。每隔3 d更换新鲜RPMI1640培养液， 补充细胞因子。②每隔5 d添加A2-SL9抗原肽刺激PBMC， 并添加细胞因子[白细胞介素-8（IL-8）、白细胞介素-15（IL-15）]， 5 d后更换培养液及添加补充细胞因子。培养时间15 d。③标记流式抗体及主要组织相容性复合体（MHC）四聚体， 流式筛选抗原特异性TSCM， 计算TSCM比例。
　　1. 4 统计学方法 采用SPSS13.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验;计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
　　2 结果
　　2. 1 通过流式细胞技术验证HIV-1抗原特异性CD8+ TSCM细胞（样本1） 根据CD8+ TSCM细胞的表位特点标记流式抗体， HIV-1抗原表位的标记需要四聚体技术， 本实验选取Tetramer-SL9作为1个抗原表位标记， 其带有PE颜色标签， 可以通过流式细胞仪监测到。首先通过选定CD8+ T细胞， 然后在CD8+ T细胞中选定CD45RO- CD45RA+的细胞亚群;进一步再选定出CD62L+ CCR7+的细胞亚群， 随后在这个亚群细胞的基础上， 选定CD95+并且CD122+双阳性的细胞， 同时被Tetramer-SL9所標记， 该群细胞就是本研究所要关注的TSCM细胞。见图1。
　　2. 2 HIV-抗原特异性TSCM细胞在CD8+T淋巴细胞中的构成 利用结果中的圈门数据分别计算10个样本中HIV-1抗原特异性TSCM细胞在CD8+ T淋巴细胞中所占比例。见图2。
　　2. 3 扩增后HIV-抗原特异性TSCM细胞在CD8+T淋巴细胞中的百分比 将患者血样分为实验组（添加细胞因子IL-8、IL-15）和对照组（无添加细胞因子）， 分别观察基线（T0）， 5 d后（T1）， 10 d后（T2）， 15 d后（T3）4个检测点TSCM细胞在CD8+ T淋巴细胞中的比例。处理前均值为0.0027%， 处理后见图3。
　　试验结果表明， 细胞因子（IL-8、IL-15）可以在体外实验中扩增CD8+ T淋巴细胞中TSCM细胞的百分比。并且随着时间延长， 可能诱导出更多的TSCM细胞， 但是峰值在10 d 左右。
　　3 讨论
　　记忆性T淋巴细胞在机体对感染性疾病和肿瘤的免疫应答中扮演着关键角色[3]， TSCM为一群缺乏快速效应细胞功能， 但具有强大增殖及自我更新潜力的细胞亚群， 它能够持续地产生记忆细胞亚群和效应细胞亚群， 这些特性使其突破移植低效率、持续时间短、缺乏调控持续免疫攻击等限制[4-6]。
　　本实验将TSCM细胞和艾滋病患者CD8+ T细胞有机地联系到一起， 利用四聚体技术标记TSCM细胞表面的HIV-1抗原表位（SL9）来鉴定HIV-1抗原特异性TSCM细胞在艾滋病患者外周血中的存在情况， 实验结果证明这群细胞的确存在于艾滋病患者体内， 但在CD8+ T淋巴细胞中所占比例很低， 而标记HIV-1抗原表位（SL9）有利于更好识别TSCM细胞。
　　本研究明确了HIV-1抗原特异性TSCM的存在情况， 通过添加细胞因子（IL-8、IL-15）， 可以明显促进TSCM细胞的形成。与此同时， 随着CD8+ T细胞数量的增加， 相应的TSCM细胞在其中的比例也随之显著增加， 在第10天达到高峰。但是， 由于细胞在培养过程中随之时间的推移， 会有不同程度的死亡， 在体外培养的第15天， CD8+ T细胞数量以及CD8+ T细胞中TSCM细胞的比例也出现下降趋势。
　　综上所述， 本研究证明了艾滋病患者CD8+ T细胞中TSCM细胞的存在， 并采用HIV-1抗原表位（SL9）来标记， 同时初步探索建立利用细胞因子（IL-8、IL-15）可能是促进TSCM细胞进行扩增的有效方法。该方法安全性能高， 扩增效果好， 可为艾滋病的过继免疫治疗提供技术参考。
　　参考文献
　　[1] 李兰娟， 任红等， 传染病学. 第8版. 北京， 人民卫生出版社， 2013：118.
　　[2] 郭宁宁， 王辉， 肖兰凤. T细胞过继免疫治疗法在肿瘤疾病治疗中的应用进展. 广东药学院学报， 2011， 27（4）：441-445.
　　[3] 占晗琳. HIV-1单纯及合并HCV感染者的HIV-1特异性细胞免疫应答研究. 广州医学院， 2011.
　　[4] Lugli E， Gattinoni L， Roberto A， et al. Identification， isolation and in vitro expansion of human and nonhuman primate T stem cell memory cells. Nature Protocols， 2012， 8（1）：33-42.
　　[5] 李丹， 鞠斌， 王硕， 等. 通过流式分选技术筛选HIV-1特异性单个B细胞. 中国热带医学， 2016， 16（11）：1074-1076.
　　[6] 宋冰冰， 陆小凡， 翁文佳， 等. HIV-1慢性感染者外周血中CD8+ 干细胞样记忆型T细胞变化以及对疾病进展的影响. 首都医科大学学报， 2017， 38（5）：650-653.
　　[收稿日期：2018-10-25]
转载注明来源:https://www.xzbu.com/6/view-14883937.htm