结核分枝杆菌耐药基因分布情况的初步探讨
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【摘 要】 目的：针对医院结核分枝杆菌耐药基因的分布情况进行分析研究。方法：收集900株ropB、KatG和inhA的MTB耐药基因分布情况。结果：MTB感染的900例患者中共检出151株ropB基因突变型，突变率16.78%，合计耐异烟肼基因突变率为19.89%（179/900），其中KatG AGC→ACC突变型占81.56%（146/179）。结论：对MTB利福平和异烟肼耐药的因素主要是ropB基因511、516、526及531位点突变和KatG AGG→ACC突变，在MTB耐药基因中可采用基因芯片技术作为快速筛选方法。
【关键词】 结核分枝杆菌;耐药基因;基因分布
【中图分类号】R766.1
【文献标志码】A
【文章编号】 1005-0019（2019）14-016-02
1 前言
世卫组织结核病报告有关数据显示，我国结核病患者位居世界第三，属于30个高负担的结核病国家。根据世卫组织估算，每年我国结核病新发患者高达90万例，其中有7万例新发患者属于耐多药结核病。对结核病防控的重要影响因素就是耐药结核分枝杆菌（MTB）传播，治疗耐多药结核患者费用相当于药物敏感患者费用的二十余倍。快速检测具有MTB及其耐药性的可精准治疗患者，能够进一步缩短患者病程，使患者疾病痛苦得到有效缓解，耐药菌株传播范围明显降低。为实现对各种MTB耐药基因分布规律进行分析比较，制定有效并适应于MTB耐药菌株的一种快速筛选方法，本研究采用基因芯片技术对检测MTB耐药基因的有关数据进行了较深入地分析。
2 资料与方法
2.1 菌株资料
收集2015年6月—2016年6月分离的900株MTB。采用核酸快速提取仪、基因微阵列芯片杂交盒、微阵列芯片扫描仪等设备及MTB耐药基因检测试剂开展相关研究工作。
2.2 方法
在核酸提取方面，从液体培养基中吸取与1个麦氏单位浊度相当的15微升菌悬液加入核酸提取管中，添加核酸提取液试剂80微升，采用核酸快速提取仪振荡5分钟，在95摄氏度温度下进行5分钟金属浴，以5000转/分钟速度进行离心1分钟，得到的核酸提取液暫存在零下20摄氏度。在核酸扩增方面，PCR扩增试剂平衡到室温，向离心瞬时到管底，主要采用每管18微升分装，分别将2微升DNA加入模板。在芯片杂交方面，杂交反应物配制比例是杂交缓冲液9微升与扩增产物3微升，加热到95摄氏度变性5分钟，然后及时进行5分钟冰水浴。将混合液13.5微升向杂交芯片加样孔中加入，置入芯片杂交盒中50摄氏度杂交2小时。在洗涤、干燥及扫描方面，枸橼酸水按照2倍标准依次与0.2%十二烷基硫酸钠进行3分钟振荡洗涤，按照800转/分钟离心5分钟，甩干后扫描，对结果进行判读。在控制质量方面，每次扩增时都采用阳性和阴性对照，阳性对照用于控制PCR扩增与杂交过程质量，阴性对照用于对环境及操作中的污染进行监测。将空白对照、阳性阴性内对照、杂交阳性外对照探针、表面化学质控探针及野生型探针都设置到每张芯片上，以实现对菌株杂交过程的有效监控。
2.3 统计分析
对患者有关数据采用SPSS 17.0数据处理软件进行分析，对患者计数资料的表示采用百分率形式，利用描述性统计分析方法进行研究。
3 结果
MTB感染的900例患者中共检出151株ropB基因突变型，突变率16.78%。ropB基因位点突变率按照由大到小为531[占50.99%（77/151）]、516[占20.53%（31/151）]、526[占15.23%（23/151）]、511[占10.59%（16/151）]、513[占1.99%（3/151）]、533[占0.67%（1/151）]。检出155株KatG突变株，突变率为17.22%（155/900），33株inhA突变型，突变率为3.67%（33/900），合计耐异烟肼基因突变率为20.89%（189/900）。其中KatG AGC→ACC突变型占81.56%（146/179）。
4 讨论
近年来，基因芯片技术属于一种MTB耐药基因检测新技术，是近年来逐渐得到业界关注的新技术之一，根据有关验证结果显示，应用此方法对利福平的耐药灵敏度和特异度检测结果分别可达到87.24%和97.36%，对异烟肼的耐药灵敏度和特异度检测结果分别可达到为80.22%和95.49%。对利福平耐药基因采用基因芯片法检测与表型检测可超过95%的相符率。在RRDR 81bp密码子上有大部分rpoB基因突变集中的表现。本研究中突变率最高的是531位点，占50.33%，与青岛的52.5%比较接近，比深圳的76.1%低。异烟肼耐药产生有关突变的比率存在比较明显的地区差异性，本研究中在异烟肼耐药中inhA突变率为3.67%，KatG突变率为17.22%，二者合计突变率为20.89%。其中KatG AGC→ACC突变型占81.56%。存在差异性的原因主要是：一是芯片对突变位点或基因型未达到完全覆盖。二是芯片检测到的突变型未能导致耐药突变;三是耐药性采用的传统药敏试验检测方法主要根据临界水平判断，与传统药敏试验临界水平相比，基因芯片法可检测到相对更低的低度耐药突变菌株。
5 结语
综上所述，导致医院中患者对MTB利福平和异烟肼耐药的因素主要是ropB基因511、516、526及531位点突变和KatGG→C突变，在MTB耐药基因中可采用基因芯片技术作为快速筛选方法。
参考文献
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