日光性角化病中RUNX3和Bcl-2蛋白表达及其临床意义探讨

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　　[摘要]目的：探討日光性角化病中人类相关转录因子（RUNX3）、B细胞淋巴瘤-2基因（Bcl-2）蛋白表达及其临床意义。方法：分别对40例正常皮肤组织、40例日光性角化病皮肤组织及40例基底细胞癌组织进行RUNX3、Bcl-2检测，通过免疫组化分析RUNX3、Bcl-2阳性表达率，并分析二者的相关性。结果：基底细胞癌组织中RUNX3、Bcl-2阳性表达率分别为95.00%、92.50%高于日光性角化病皮损组织中二者的阳性表达率（80.00%、75.00%），且高于正常皮肤组织（57.50%、32.50%），差异有统计学意义（P<0.05）。RUNX3、Bcl-2在日光性角化病中共同表达阳性28例，共同表达阴性6例，经Spearman相关性分析，RUNX3、Bcl-2在日光性角化病中呈现正相关（r=0.577，P<0.05）。RUNX3、Bcl-2蛋白在肥厚型、萎缩型、鲍温样型、棘层松懈型、苔藓样型病理亚型日光性角化病中的阳性表达率比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：RUNX3、Bcl-2在日光性角化病组织中高表达，二者阳性表达率呈现正相关，且在不同病理亚型日光性角化病中的阳性表达率无差异。
　　[关键词]日光性角化病;基底细胞癌;RUNX3;Bcl-2;免疫组化法;阳性表达率
　　[中图分类号]R758.1    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2020）01-0058-04
　　Expression of RUNX3 and Bcl-2 Proteins in Solar Keratosis and Their Clinical Significance
　　KAN Bei1，HAN Li1，ZHANG Yong1，LIU Yan1，LI Fan2
　　（1.Department of Dermatology;2.Department of Pathology，Chengdu Second People's Hospital，Chengdu 610000，Sichuan，China）
　　Abstract： Objective  To investigate expression of human runt-related transcription factor 3 （RUNX3） and B-cell lymphoma-2 gene （Bcl-2） in solar keratosis （SK） and their clinical significance. Methods  R RUNX3 and Bcl-2 were detected in 40 normal skin tissues， 40 actinic keratosis skin tissues and 40 basal cell carcinoma tissues respectively. Immunohistochemistry was performed to analyze positive expression rates of RUNX3 and Bcl-2， and their correlation. Results  The positive expression rates of RUNX3 and Bcl-2 in basal cell carcinoma tissues were 95.00% and 92.50%， respectively， higher than those in SK skin lesion tissues （80.00%， 75.00%）， and higher than those in normal skin lesion tissues （57.50%， 32.50%）， the differencea were statistically significant（P<0.05）. There were 28 cases with positive expression of RUNX3 and Bcl-2 in SK， and 6 cases with negative expression of the two. Spearman correlation analysis showed that RUNX3 was positively related with Bcl-2 in SK （r=0.577， P<0.05）. There was no significant difference in positive expression rate of RUNX3 or Bcl-2 protein among SK of hypertrophic type， atrophic type， bowenoid type， nikolsky type and lichenification type （P>0.05）. Conclusion  RUNX3 and Bcl-2 are highly expressed in SK tissues. The positive expression rates of them are positively correlated. And there is no difference in positive expression rate of the two among SK with different pathological subtypes.
　　Key words： solar keratosis; basal cell carcinoma; RUNX3; Bcl-2; immunohistochemistry; positive expression rate 　　日光性角化病是常发于老年人的皮肤病，通常被认为是皮肤鳞状细胞癌癌前病变，多发于男性，主要与长期日晒有关，多见于面部、手背等暴露部位，皮损主要为黄豆到蚕豆大小的角化过度性斑块，早期和正常肤色较为接近，之后呈现暗褐色，周围有轻度的红晕，表面较为粗糙[1]。人类相关转录因子（Human runt-related transcription factor 3，RUNX3）为抑癌基因，在许多肿瘤中均呈现出失活状态，失活机制主要与启动子区高甲化和杂合性缺失有关，与恶性肿瘤的发生、发展及预后中具有重要作用[2]。B细胞淋巴瘤-2基因（B-cell-lymponma-2，Bcl-2）为细胞凋亡研究过程中受到广泛关注的癌基因之一，具有抑制凋亡的作用，是凋亡分子机制研究的主要靶分子[3]。本研究探讨中RUNX3、Bcl-2在日光性角化病中的表达水平，分析其在日光性角化病发展中的作用和临床意义。
　　1  材料和方法
　　1.1 材料：选取笔者医院2012年5月-2015年2月日光性角化病患者存档的石蜡标本40例，男性24例，女性16例;年龄49～71岁，平均（55.14±5.71）岁;曝光标本20例，非曝光标本20例。基底细胞癌病变患者存档石蜡标本40例，男性23例，女性17例;年龄47～74岁，平均（55.23±5.76）岁;曝光标本20例，非曝光标本20例。另选同期正常皮肤标本40例，男性25例，女性15例;年龄48～73岁，平均（55.20±5.87）岁;曝光标本20例，非曝光标本20例。
　　1.2 方法
　　1.2.1 试剂：RUNX3兔抗人多克隆抗体（Active Motif公司），Bcl-2多克隆抗体（Santa cruz），PV-9000二步法免疫组化检测试剂及浓缩型DAB试剂盒（北京中杉生物试剂公司）。
　　1.2.2 切片制作及免疫组化：标本均通过中性甲醛液进行固定，采用石蜡进行包埋，4μm切片，采用常规免疫组化方法进行试验，一抗浓度分别为RUNX3（1：300），Bcl-2（1：50），4℃条件下过夜处理。PBS冲洗3次，每次时间为5min，滴加PV-9000试剂1，室温条件下孵育20min;PBS冲洗3次，每次时间为5min，滴加PV-9000试剂2，室温条件下孵育20min。PBS冲洗3次，每次时间为5min，进行DAB显色反应，通过苏木素染色20s，脱水透明，进行封片。
　　1.3 结果判定：RUNX3阳性细胞即为细胞质呈现棕黄色颗粒的阳性反应产物，Bcl-2阳性染色即为棕黄色颗粒定位在细胞浆，有时伴有胞膜或（和）核膜呈棕黄色。于低倍镜下观察免疫组化表达情况，选择相对较为集中的10个视野，换取高倍镜进行阳性细胞计数，依照阳性细胞所占比例以及染色深浅进行等级划分，共包括4个等级[4]：阳性细胞计数<10%或未染色则为（-）;阳性细胞计数为10%～25%且为黄色染色则为（+）;阳性细胞计数为26%～50%且为黄色染色（++）;阳性细胞计数为51%～75%且为棕黄色染色则为（+++）;阳性细胞计数>75%且为深棕黄染色则为（++++）。
　　1.4 统计学分析：采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，样本率比较通过卡方检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
　　2  结果
　　2.1 三组RUNX3、Bcl-2的表达情况：40例日光性角化病皮损组织中RUNX3阳性表达率为80.00%（32/40），Bcl-2阳性表达率为75.00%（30/40）;40例正常皮肤组织中RUNX3阳性表达率为57.50%（23/40），Bcl-2阳性表达率为32.50%（13/40）;40例基底细胞癌组织中RUNX3阳性表达率为95.00%（38/40），Bcl-2阳性表达率为92.50%（37/40）。基底细胞癌组织中RUNX3与Bcl-2阳性表达率高于日光性角化病皮损组织，日光性角化病皮损组织中RUNX3与Bcl-2阳性表達率高于正常皮肤组织皮损，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。
　　
　　2.2 RUNX3、Bcl-2在日光性角化病中表达的相关性：RUNX3、Bcl-2在日光性角化病中共同表达阳性28例，共同表达阴性6例，经Spearman相关性分析，RUNX3、Bcl-2在日光性角化病中呈现正相关（r=0.577，P<0.05）。见表2。
　　
　　2.3 RUNX3、Bcl-2蛋白在不同病理亚型日光性角化病中的表达：RUNX3、Bcl-2蛋白在肥厚型、萎缩型、鲍温样型、棘层松懈型、苔藓样型病理亚型日光性角化病中的阳性表达率比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。
　　2.4 RUNX3、Bcl-2在正常皮肤组织及日光性角化病中的表达特点：40例正常皮肤组织中，RUNX3基因主要表达在表皮基底层细胞和近基底层细胞的细胞质中，并从基底层到角质层中沉陷出染色密度和强度逐渐减弱，而在汗腺、毛囊以及皮脂腺周围的基底样细胞中也可见RUNX3的阳性表达，在胞质内呈现棕黄色的颗粒沉积，同时在脂肪细胞和间叶组织细胞中无表达。在40例日光性角化病中，RUNX3主要在表皮基底层和棘层中下约1/3的细胞质内表达，在棘层中部阳性表达则较为散在，基底层细胞质内呈现棕褐色颗粒沉积，棘层细胞的胞质内呈现棕黄色的颗粒沉积，同时染色的密度及强度均减弱，真皮乳头层有少数淋巴细胞染色呈现阳性。见图1～2。正常皮肤组织中Bcl-2在上层基底层阳性表达，日光性角化病皮损组织中Bcl-2在胞浆中阳性表达，见图3～4。
　　3  讨论
　　皮肤为人体最大器官，若长期暴露于外界环境中，尤其是紫外线照射后皮肤可能发生一系列的临床和组织学改变，严重时甚至导致癌前病变或肿瘤[5]。日光性角化病多发于50岁以上的中老年人群，其究竟为早期的鳞状细胞癌还是癌前病变目前尚未明确定论，可进一步发展为侵袭性鳞癌，是一个由正常组织到鳞癌的中间过程，这一阶段细胞生物学行为非常不稳定，因此相对于鳞癌细胞其更易接受向良性转变的分化诱导[6-7]。此阶段若能阻断癌变进程，则可有效预防其发展成为恶性肿瘤，因此，深入研究该病具有广泛的应用前景和特殊意义。 　　RUNX3基因最早在胃癌中作为抑癌基因被发现，其表达和上调失活将影响胃癌的发生与发展，之后在肺癌、直肠癌、瘢痕疙瘩等多种肿瘤病变中均被证实为抑癌基因，抑癌学说最早也是通过RUNX3在胃癌中的研究提出的[8]。RUNX3基因在乳腺癌、胃癌、肝癌、结肠癌等多种肿瘤中均呈现低表达，而在正常组织中呈现出高表达，体现出RUNX3的抑制肿瘤作用[9-10]。然而近年来有学者研究表明RUNX3具有抑癌作用机制，和之前的研究相反，RUNX3基因在鳞状细胞癌、头颈部肿瘤、皮肤基底细胞上皮瘤中的表达均高于正常组织，推测出RUNX3的过表达可能与肿瘤的产生有关，RUNX3具有致癌作用[11-12]。RUNX3基因的表达增加或者下降常常伴随着肿瘤的发生，其表达水平和肿瘤的分期和细胞分化程度以及癌细胞的转移有密切关系[13-14]。目前关于RUNX3在皮肤癌前病变的作用机制和临床意义逐渐引起了人们的关注，本研究通过免疫组织化学技术对正常皮肤组织及日光性角化病组织进行染色，研究发现RUNX3基因在日光性角化病组织中的阳性表达率80.00%高于正常皮肤组织57.50%，且基底细胞癌组织中表达率95.00%高于日光性角化病组织，表明RUNX3的致癌作用。Melamed RD等[15-16]研究发现，RUNX3在转移性黑素瘤、原发黑素瘤、发育不良痣以及普通痣中阳性表达率分别为24%、33%、54%、56%，与本研究结果一致。除此之外本研究还发现基底细胞癌组织中RUNX3阳性表达率较日光性角化病皮损组织更高，说明RUNX3可能与日光角化病组织的进一步恶化有关。本研究中光镜下正常皮肤组织与日光性角化病组织中RUNX3的表达部位具有一定的差异，接下来的研究过程中可进一步比较分析不同皮肤组织中RUNX3阳性表达分布情况，为临床诊断提供参考。
　　Bcl-2是一种和程序性细胞凋亡有关的抑制癌基因，凋亡Bcl-2蛋白在控制线粒体凋亡中具有平衡作用，其比率被认为在诱导细胞的凋亡过程中具有决定性作用，并同时可能缩短细胞的周期，从而促进肿瘤的生长，表达多位于角质形成的细胞基底层、毛乳头间质细胞以及外分泌腺的透明细胞、皮肤黑色素细胞、淋巴细胞中[17-18]。本研究中Bcl-2在日光性角化病组织中阳性表达率为75.00%，与国内姜莉等[19-20]研究结果相似。分析RUNX3与Bcl-2在日光性角化病中表达的相关性，发现RUNX3、Bcl-2在日光性角化病中呈现正相关，推测RUNX3基因可能通过激活Bcl-2的转录，两者协同发挥作用。本研究中日光性角化病组织中有肥厚型、萎缩型、鲍温样型、棘层松懈型、苔藓样型几种病理亚型，其中肥厚型表现为角化过度明显，角质层高度超过宽度，棘层肥厚，呈现轻中度的乳头瘤样增生，核分裂现象较多;萎缩型表现为表皮萎缩，基底细胞层增生，细胞排列较为紊乱、紧密，部分基底细胞核较大;鲍温样型表现为全层表皮存在异型细胞增生，与原位鳞癌类似，但其基底层有日光角化病的特点;棘层松懈型表现为基底层不典型细胞上方有棘突松懈，形成不规则的裂隙，裂隙中存在棘层松懈细胞，下方可见芽蕾状细胞突向真皮乳头;苔藓样型表现为真皮乳头层以及血管周围有致密的带状淋巴细胞浸润，比较RUNX3、Bcl-2蛋白在不同病理亚型日光性角化病中的阳性表达率无明显差异，后续可进一步扩大样本量进行对比分析。
　　综上所述，RUNX3、Bcl-2在日光性角化病组织中高表达，二者阳性表达率呈现正相关，且在不同病理亚型日光性角化病中的阳性表达率无差异。
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　　[收稿日期]2019-06-22
　　本文引用格式：阚蓓，韩莉，张勇，等.日光性角化病中RUNX3和Bcl-2蛋白表达及其临床意义探讨[J].中国美容医学，2020，29（1）：58-61.
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