地黄饮子对D-半乳糖衰老模型大鼠学习记忆能力及衰老相关蛋白P16、P21的影响

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　　【摘要】 目的 通过探讨地黄饮子对衰老大鼠学习记忆能力及衰老相关蛋白P16、P21的影响， 研究地黄饮子对于延缓衰老的作用。方法 50只SD大鼠， 随机分为正常组、衰老组、地黄饮子组、六味地黄丸组、维生素E组， 每组10只。除正常组外， 每组颈背部皮下注射D-半乳糖380 mg/kg， 连续3个月。同时地黄饮子组、六味地黄丸组、维生素E组分别给予地黄饮子、六味地黄丸、维生素E灌胃。用Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力， 用Western blot检测大鼠海马中P16、P21蛋白的表达。比较五组大鼠到达平台时间、经过平台次数;海马中P16、P21蛋白表达水平。结果 衰老组大鼠经过平台次数为（2.21±1.56）次低于正常组的（6.43±1.21）次， 到达平台时间为（75.33±4.22）s长于对照组的（36.68±4.10）s， 差异具有统计学意义（P<0.05）。地黄饮子组大鼠到达平台时间（45.92±3.84）s短于衰老组的（75.33±4.22）s、维生素E组的（58.23±3.69）s， 经过平台次数（6.82±1.22）次高于衰老组的（2.21±1.56）次、维生素E组的（5.09±1.61）次， 差异具有统计学意义（P<0.05）。地黄饮子组大鼠到达平台时间、经过平台次数与六味地黄丸组比较差异无统计学意义（P>0.05）。衰老组大鼠海马中P16、P21蛋白表达水平分别为（0.44±0.01）、（0.49±0.02）ng/ml高于正常组的（0.32±0.01）、（0.25±0.02）ng/ml， 差异具有统计学意义（P<0.05）。地黄饮子组大鼠海马中P16、P21蛋白表达水平低于衰老组、六味地黄丸组、维生素E组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 地黄饮子方能够提高衰老大鼠的学习记忆能力， 通过降低大鼠体内P16、P21的含量从而达到延缓衰老的目的。
　　【关键词】 地黄饮子;衰老;P16;P21
　　DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.04.090
　　中国正快速步入老龄化社会， 衰老和死亡是任何物种的个体都难以避免的最终结局， 但至今对衰老发生机制的理解还相当有限。鉴于其重要性， 衰老一直是生物学研究的热点。如何发挥中医中药的优势， 采用中西医结合的方法， 优势互补， 最大程度的提高老年人的生活质量， 延缓老年人脏器的衰老， 防治重大老年性疾病， 成为亟待解决的重大问题。本研究通过观察地黄饮子对实验室衰老后SD大鼠日常生活能力及衰老蛋白P16、P21的表达高低， 探讨以地黄饮子为代表的补肾法对延缓衰老的意义。现报告如下。
　　1 材料与方法
　　1. 1 实验动物 50只8周龄SD雄性大鼠， 体重（225±12）g， 广州中医药大学附属第一医院提供合格实验动物， 动物许可证：SYYK（粤）2018-0012。饲养环境温度约22℃， 湿度55%～65%， 饮用水为纯净水。处置动物严格遵守实验动物伦理学标准[1]。将50只SD大鼠随机分为正常组、衰老组、地黄饮子组、六味地黄丸组、维生素E组， 每组10只。
　　1. 2 药物 地黄饮子药物组成：均为道地药材， 其中菟丝子15 g、山萸肉20 g、牛膝10 g、鹿角胶15 g、龟板胶10 g、熟地黄30 g、淮山15 g、枸杞15 g（由广州中医药大学深圳医院煎制）。其中除龜板胶、鹿角胶烊化外， 将其他所有药物混合煎煮， 待药物有效成分析出外， 浓缩， 置于冰箱保存。
　　1. 3 实验试剂及主要仪器
　　1. 3. 1 主要试剂 Western blot主要试剂：来自Santa公司的P21多克隆抗体、P16单克隆抗体;来自Amresco公司的D-半乳糖、其他原料均来自广州中医药大学实验室已有原料。
　　1. 3. 2 主要仪器 水平摇床、凝胶电泳仪、核酸蛋白测定仪、大鼠水迷宫实验装置等设备。
　　1. 4 方法
　　1. 4. 1 模型的制备 制备衰老大鼠动物模型参照相关文献[2， 3]：除正常组外， 每组颈背部皮下注射D-半乳糖380 mg/kg， 连续3个月。同时地黄饮子组、六味地黄丸组、维生素E组分别给予地黄饮子、六味地黄丸、维生素E灌胃。喂养到期后将大鼠处死， 分离海马， 放组织液中保存。
　　1. 4. 2 大鼠学习记忆能力检测 测试方法水迷宫水池的设置、定位航行实验参照有关文献[5]。
　　1. 4. 3 P16、P21蛋白检测 采用Western blot免疫印迹法检测P16、P21蛋白， 参照自身实验室Western blot步骤及查阅相关文献[6]。
　　1. 5 观察指标 比较五组大鼠到达平台时间、经过平台次数;海马中P16、P21蛋白表达水平。
　　1. 6 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验;计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
　　2 结果
　　实验过程中出现大鼠的非正常死亡例数：正常组0例， 衰老组1例， 地黄饮子组1例， 六味地黄丸组2例， 维生素E组0例。
　　2. 1 五组大鼠到达平台时间、经过平台次数比较 衰老组大鼠经过平台次数低于A组正常组， 到达平台时间长于对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。地黄饮子组大鼠到达平台时间短于衰老组、维生素E组， 经过平台次数高于衰老组、维生素E组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。地黄饮子组大鼠到达平台时间、经过平台次数与六味地黄丸组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
　　2. 2 五组大鼠海马中P16、P21蛋白表达水平比较 衰老组大鼠海马中P16、P21蛋白表达水平高于正常组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。地黄饮子组大鼠海马中P16、P21蛋白表达水平低于衰老组、六味地黄丸组、维生素E组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见表2， 图1， 图2。 　　3 讨论
　　衰老是人类正常生命活动的自然规律， 人类的机体在生长发育完成之后， 便逐渐进入衰老的过程。探讨衰老的概念、原因和衰老时的生理、病理改变， 以至防止衰老的措施， 是十分重要的。
　　衰老可分为两类， 即生理性衰老及病理性衰老。生理性衰老系指随年龄的增长到成熟期以后所出现的生理性退化， 也就是人体在体质方面的年龄变化， 这是一切生物的普遍规律。病理性衰老即由于内在的或外在的原因使人体发生病理性变化， 使衰老现象提前发生， 这种衰老又称为早衰。
　　肾为先天之本， 人的生长发育衰老与肾脏的关系极为密切。《素问·上古天真论》中“女子七七”、“丈夫八八”的一段论述， 即是以肾气的自然盛衰规律， 来说明人体生长、发育、衰老的过程与先天禀赋的关系， 从而提示衰老的关键在于肾气的盛衰。肾属水， 主藏精， 为元气之本， 一身阴阳生化之根。肾的盛衰影响着元气的盛衰和生化功能的强弱， 肾虚则元气衰， 元气衰则生化功能弱， 人的衰老就会加速到来。
　　人的生命活动， 靠脏腑气血充盛、功能协调来维持。肾为先天之本， 对人的生长、发育、衰老起着决定性的作用。肾气虚损， 五脏六腑功能减退， 则出现一系列衰老征象， 这是人类变老的重要原因。肾气充盛即能抗病又能抗衰老延年益寿。中医学在抗衰老理论上， 补肾法延缓衰老具有重要的临床意义。本研究中地黄饮子方用熟地黄、山茱萸滋补肾阴， 肉苁蓉、巴戟天温壮肾阳， 四味共为君药。配伍附子、肉桂之辛热， 以助温养下元， 摄纳浮阳， 引火归原;石斛、麦冬、五味子滋养肺肾， 金水相生， 壮水以济火， 均为臣药。石菖蒲与远志、茯苓合用， 是开窍化痰， 交通心肾的常用组合， 是为佐药。姜、枣和中调药， 功兼佐使。
　　细胞的衰老是机体衰老最重要的因素之一， 对于衰老机制的研究也在不断深化 [9-11]。本研究观察补肾生髓方剂地黄饮子对衰老大鼠的干预， 结果显示：衰老组大鼠经过平台次数低于A组正常组， 到达平台时间长于对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）， 提示制造衰老模型后明显降低了大鼠的日常生活能力。地黄饮子组大鼠到达平台时间短于衰老组、维生素E组， 经过平台次数高于衰老组、维生素E组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。地黄饮子组大鼠到达平台时间、经过平台次数与六味地黄丸组比较差异无统计学意义（P>0.05）， 提示地黄饮子一方面能提高大鼠经过平台的次数， 同时到达平台的潜伏期也明显缩短， 说明地黄饮子能提高大鼠学习、记忆能力。衰老组大鼠海马中P16、P21蛋白表达水平高于正常组， 差异具有统计学意义（P<0.05）， 说明衰老大鼠中P16、P21蛋白表达增高。地黄饮子组大鼠海马中P16、P21蛋白表达水平低于衰老组、六味地黄丸组、维生素E组， 差异具有统计学意义（P<0.05）。得出补肾生髓中药可以明显延缓机体衰老， 补肾生髓法能够提高大鼠学习记忆能力， 并能够明显下调P16、P21的表达水平来达到延缓衰老的目的。证明 “肾主骨生髓” 中医理论在延缓衰老机制中的正确性和可操作性。
　　综上所述， 遵循“肾-精-髓-脑”理论， 采用补肾生髓中药地黄饮子对延缓机体衰老是有希望的， 在中医理论指导下的实验研究， 不仅为延缓衰老提供了研究的新思路和新方案， 而且有利于医学的进步和发展， 开拓新的治疗方法。
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　　[收稿日期：2019-05-20]
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