外源性CGRP对ALI大鼠BALF中TNF-α、IL-1β表达的影响

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　　 【摘要】 目的：觀察外源性降钙素基因相关肽（CGRP）对脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤（ALI）大鼠肺泡灌洗液（BALF）肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）表达的影响。方法：42只SD雄性大鼠随机分为生理盐水对照组（NS组）、CGRP对照组（CGRP组）、急性肺损伤组（ALI组，14只）和CGRP干预组（CGRP干预组，14只）四组，其中ALI组分为6 h ALI组和12 h ALI组两亚组，干预组分为CGRP+6 h ALI组和CGRP+12 h ALI组两亚组，每亚组7只。ALI组按LPS 10 mg/kg于尾静脉注射后6 h和12 h后取材;干预组予CGRP（5 μg/kg）尾静脉注射后1 h，再予LPS （10 mg/kg）尾静脉注射后分别于第6小时和第12小时后取材;CGRP对照组予CGRP（5 μg/kg）尾静脉注后6 h取材;NS组予生理盐水（1 ml/kg）静脉注射后6 h取材。记录并比较各组SD大鼠BALF细胞计数及分类计数和湿/干重比值（W/D）;HE染色观察各组肺组织病理变化情况;ELISA法检测各组大鼠BALF TNF-α、IL-1β的表达水平。结果：ALI组大鼠BALF细胞总数和分类计数、W/D比值、TNF-α、IL-1β的表达量均高于NS组，差异有统计学意义（P<0.05）;同时间点损伤组与干预组比较，BALF细胞分类计数、TNF-α、IL-1β的表达均增加，差异有统计学意义（P<0.05）。NS组与CGRP对照组大鼠BALF细胞总数及分类计数、TNF-α和IL-1β的表达差异无统计学意义（P>0.05）。结论：外源性CGRP可降低大鼠BALF中TNF-α、IL-1β的含量，对LPS诱导的ALI大鼠具有抗炎作用。
　　 【关键词】 急性肺损伤 肿瘤坏死因子-α 白细胞介素-1β 炎症反应
　　 [Abstract] Objective： To observe the intervention effect of calcitonin gene-related peptide （CGRP） on the expression of TNF-α and IL-1β in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） of lipopolysaccharide （LPS） induced acute lung injury （ALI） rats. Method： Forty-two SD rats were randomly divided into 6 groups according to a random number method， 7 rats in each group. The 6 groups were listed as normal saline control group （NS group）， CGRP control group （CGRP group）， 6-hour acute lung injury group （6 h ALI group）， 12-hour acute lung injury group （12 h ALI group）， CGRP intervention 6-hour group （CGRP+6 h ALI group）， and CGRP 12-hour group （CGRP+12 h ALI group）. 6 h ALI group and 12 h ALI group were treated with LPS （10 mg/kg） via tail vein and specimen obtained at 6 hours and 12 hours respectively. CGRP+6 h ALI group and CGRP+12 h ALI group were injected with CGRP （5 μg/kg） by tail vein and injected with LPS （10 mg/kg） after 1 h of CGRP injection， specimen obtained at 6 hours and 12 hours respectively. After the tail vein injection of CGRP （5 μg/kg）， the specimen of CGRP group was obtained 6 hours later; after the tail vein was injected with （1 ml/kg） of normal saline， the specimen of NS group was obtained 6 hours later. After that， BALF cell counts and differential counts were performed in each group ; right upper lung tissues were used to determine the wet/dry weight ratio （W/D）; pathological changes of lung tissues in each group were observed by HE staining; ELISA was used to measure the levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-1β （IL-1β） in BALF of each group. Result： The ALI group compared with NS group ， BALF cell counts and differential counts， the wet/dry weight ratio （W/D）， the expression of TNF-α and IL-1β were increased， the differences were statistically significant （P<0.05）. The ALI group compared with CGRP intervention group at the same time， BALF cell differential counts， and the expression of TNF-α and IL-1β were increased， the differences were statistically significant （P<0.05）. There were no significantly differences in BALF cell counts and differential counts， the expression of TNF-α and IL-1β between NS group and CGRP group （P>0.05）. Conclusion： CGRP possesses potential protection against LPS-induced acute lung injury through its anti-inflammatory property. 　　
　　 急性肺损伤（acute lung injury，ALI）或急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是由各种肺内和肺外致病因素导致的急性弥漫性肺损伤和进而发展的急性呼吸衰竭，是临床常见的急危重症之一[1]。ALI/ARDS起病急、发展迅速，缺乏特异性和有效的治疗手段，病死率高达40%以上[2]。目前研究表明，炎症反应是ALI/ARDS发生发展的关键机制。降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）是一种新型的抗炎介质，文献[3]报道CGRP可减轻ALI/ARDS的炎症反应。本研究拟予尾静脉注射LPS的方式构建ALI大鼠模型，予外源性CGRP进行干预，通过检测各组ALI大鼠BALF 细胞计数及分类计数、TNF-α和IL-1β表达水平，探讨CGRP是否抑制TNF-α、IL-1β的表达来实现对ALI/ARDS的保护作用。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠42只，6～8周龄，体重180～220 g，重庆第三军医大学动物实验中心[合格证编号为SCXK（渝）2012-0005]提供，在标准动物饲养间给予无菌食物和水饲养。将42只大鼠随机分为生理盐水对照组（NS组，7只）、CGRP对照组（CGRP组，7只）、急性肺损伤组（ALI组，14只）和干预组（CGRP干预组，14只），其中急性肺损伤组分为6 h ALI组和12 h ALI组两亚组，干预组分为CGRP+6 h ALI组和CGRP+12 h ALI组两亚组，每亚组7只。
　　1.1.2 主要实验试剂及药物 脂多糖（LPS）购于美国Sigma公司，降钙素基因相关肽（CGRP）购于Tocris公司，ELISA试剂盒购于购于美国R&D公司。
　　1.2 动物模型的建立
　　 ALI组按LPS 10 mg/kg于尾静脉注射，6 h和12 h后取材;干預组予CGRP（5 μg/kg）尾静脉注射，CGRP注射成功后1 h按LPS（10 mg/kg）尾静脉注射，分别于6 h和12 h后取材;CGRP组尾静脉注CGRP（5 μg/kg）6 h后取材;NS组尾静脉注射生理盐水1 ml/kg，6 h后取材。
　　1.3 指标检测
　　1.3.1 BALF中性粒细胞计数 取各组SD大鼠BALF 10 μl滴于细胞计数板上，光镜下按计数板上的细胞数目。将BALF离心后取20 μl沉淀涂片（每个标本涂2～3张），待涂片晾干后进行瑞氏-吉姆萨染色，采取单盲法在油镜下计数200个细胞，计数各组中性粒细胞所占的百分比。
　　1.3.2 肺组织湿/干重比值（W/D） 用滤纸吸干右肺上叶肺组织表面血液及水分，电子天平称量记为湿重（W），置于80 ℃恒温箱烤48 h后称量记为干重（D），计算湿/干重比（W/D），W/D值反映肺水肿的严重程度。
　　1.3.3 肺组织病理改变 肺组织经石蜡包埋后 ，切4 μm切片，常规HE染色，观察肺组织病理变化。
　　1.3.4 ELISA法检测BALF中TNF-α、IL-β含量 灌洗左肺收集BALF，4 ℃下3 000 r/min离心5 min，取上清，-80 ℃保存备用。ELISA法检测BALF上清液中TNF-α、IL-β的含量，严格按照ELISA试剂盒说明书操作进行。
　　1.4 统计学处理
　　 试验数据通过SPSS 17.0软件分析系统分析，计量资料以（x±s）表示。多样本均数比较时采用单因素方差分析，方差齐者使用LSD检验，方差不齐者使用Dunnett’s T3检验，以α=0.05为检验校正标准，P<0.05表示差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 BALF细胞计数及分类计数
　　 与NS组比较，6 h ALI组、CGRP+6 h ALI组、12 h ALI组和CGRP+12 h ALI组大鼠BALF中性粒细胞百分比多，差异有统计学意义（P<0.05）;与6 h ALI组比较，CGRP+6 h ALI组、12 h ALI组BALF中性粒细胞百分比低，差异有统计学意义（P<0.05）;与12 h ALI组比较，CGRP+12 h ALI组大鼠BALF中性粒细胞百分比低，差异有统计学意义（P<0.05）;CGRP+12 h ALI组大鼠BALF中性粒细胞百分比与CGRP+6 h ALI组比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
　　2.2 肺组织湿/干重（W/D）比值测定
　　 与NS组比较，6 h ALI组、CGRP+6 h ALI组、12 h ALI组和CGRP+12 h ALI组大鼠肺组织W/D比值大，以12 h ALI组较为明显，差异有统计学意义（P<0.05）;与6 h ALI组比较，CGRP+6 h ALI组肺组织W/D比值小，12 h ALI组肺组织W/D比值大，差异均有统计学意义（P<0.05）;与12 h ALI组相比较，CGRP+12h ALI组肺组织W/D比值减小，差异有统计学意义（P<0.05）;CGRP+12 h ALI组肺组织W/D比值与CGRP+6 h ALI组比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。
　　2.3 各组肺组织HE染色病理改变
　　 参照Jin等[4]文献中的方法进行肺损伤病理学评价。NS组大鼠肺组织细胞形态学正常，组织完整，气管壁及肺泡壁结构清晰，黏膜完整，管腔通畅，无明显炎症细胞浸润;6 h ALI组和12 h ALI组大鼠肺组织病理提示气管及血管周围呈现以中性粒细胞为主的炎症细胞浸润，肺间质中炎症细胞浸润明显，黏膜充血水肿，小叶间隔增宽、增厚;CGRP+6 h ALI组和CGRP+12 h ALI组大鼠肺组织病理提示气管及血管周围出现以嗜中性粒细胞为主的炎症细胞浸润，肺间质炎症细胞浸润;黏膜充血水肿，气道上皮细胞及杯状细胞肿胀，小叶间隔增宽、增厚，但较相应的ALI组减轻，见图1。 　　2.4 ELISA法检测大鼠BALF中TNF-α含量
　　 与NS组比较，6 h ALI组、CGRP+6 h ALI组、12 h ALI组和CGRP+12 h ALI组大鼠BALF TNF-α含量多，差异均有统计学意义（P<0.05）;与6 h ALI组比较，CGRP+6 h ALI组大鼠BALF TNF-α含量少，12 h ALI组大鼠BALF TNF-α含量多，差异均有统计学意义（P<0.05）;与12 h ALI组相比较，CGRP+12 h ALI组大鼠BALF TNF-α含量少，差异有统计学意义（P<0.05）;与CGRP+6 h ALI组比较，CGRP+12 h ALI组大鼠BALF TNF-α含量多，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。
　　2.5 ELISA法检测大鼠BALF中IL-1β含量
　　 与NS组比较，6 h ALI组、CGRP+6 h ALI组、12 h ALI组和CGRP+12 h ALI组大鼠BALF IL-1β含量多，差异有统计学意义（P<0.05）;与6 h ALI组比较，CGRP+6 h ALI组IL-1β含量少，12 h ALI组大鼠BALF IL-1β含量多，差异均有统计学意义（P<0.05）。与12 h ALI组比较，CGRP+12 h ALI组大鼠BALF IL-1β含量少，差异有统计学意义（P<0.05）。与CGRP+6 h ALI组比较，CGRP+12 h ALI组大鼠BALF IL-1β含量多，差异有统计学意义（P<0.05），见表4。
　　3 讨论
　　 ALI/ARDS是由创伤、严重感染、中毒等多种因素导致全身炎症反应综合征的肺部表现，主要病理特征是炎症反应导致的肺微血管内皮及肺泡上皮受损，微血管通透性增高，肺泡腔渗出富含蛋白的液体，进而引起肺水肿及透明膜形成，临床表现为呼吸窘迫、難治性低氧血症和呼吸衰竭，肺部影像学表现为双肺弥漫性渗出性改变[5]，是目前呼吸系统急危重症疾病研究的难点和热点之一，但ALI/ARDS发病机制尚未安全阐明并且预后不良。
　　 近年来，随着对ALI/ARDS的发病机制不断深入研究，发现炎症细胞和炎症介质参与的炎症反应在ALI/ARDS的发生发展中起关键作用。炎症细胞产生多种炎症介质和细胞因子，最重要的是TNF-α、IL-1β，导致大量中性粒细胞肺内聚集、激活，并通过“呼吸暴发”释放氧自由基、蛋白酶和炎症介质，引起靶细胞损害，表现为肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤，肺微血管通透性增高和微血栓形成，最终导致肺部弥漫性肺间质及肺泡水肿，从而引起呼吸窘迫、顽固性低氧血症[5]。研究表明，脓毒症是ALI/ARDS常见原因之一，脓毒症伴发的全身严重炎症反应是急性肺损伤的主要发病机制[6-7]，革兰阴性杆菌感染是脓毒症最常见的病因[8]，而脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰阴性杆菌细胞壁的主要组分之一，对脓毒症的发生和发展发挥着重要的作用[9]。ALI的主要病理改变包括肺组织中炎性细胞浸润，肺间质和肺泡出血和水肿，肺泡毛细血管屏障受损，通透性增加[10]。本研究采用10 mg/kg LPS尾静脉注射制备大鼠ALI模型，结果显示，ALI组大鼠各时相BALF中性粒细胞计数、W/D比值均高于NS组，并且肺组织病理切片见毛细血管明显充血，肺泡及间质见大量中性粒细胞浸润，肺泡腔内可见红细胞渗出，肺泡隔增宽、紊乱，提示尾静脉注射LPS已成功建立大鼠ALI模型。
　　 研究表明，在炎症反应的发生发展过程中TNF-α是始动因素，IL-1β发挥协同作用[11]。IL-1β不能直接活化白细胞，但可以引起IL-8的分泌，通过改变前炎症介质或抗炎症细胞因子的表达和影响组织多型核中性粒细胞聚集而促进炎症的发展[12]。可见TNF-α、IL-1β炎症介质在ALI发病中起着重要的作用。本研究结果显示，ALI组大鼠各时相BALF释放的炎症因子TNF-α、IL-β明显高于NS组（P<0.05），提示TNF-α和IL-1β被激活，参与炎症的级联式放大反应，促进ALI的发生与发展。
　　 CGRP是由37个氨基酸组成的小分子多肽，由降钙素基因选择性剪切编码后合成，参与机体多种生理和病理过程[13]。奎莉越等[14]研究显示，CGRP干预可抑制脂多糖（LPS）诱导的大鼠肺上皮细胞炎症因子的分泌。CGRP不仅有扩张血管、减轻肺水肿，还有抗炎的作用。本研究结果显示，CGRP干预组大鼠W/D的比值、BALF中白细胞计数、中性粒细胞百分比、TNF-α、IL-β均低于相同时间点ALI组大鼠，提示外源性CGRP可抑制LPS诱导的ALI大鼠肺组织的炎症反应及肺水肿，对ALI具有保护作用。
　　 综上所述，炎症反应是ALI/ARDS的主要发病机制之一，炎症介质TNF-α和IL-1β的激活，参与炎症的级联放大效应，促进ALI/ARDS的发生与发展。本研究说明CGRP作为新型的抗炎介质，通过降低炎症介质（TNF-α、IL-1β等）的释放，减轻了肺脏的损伤，减轻了肺水肿，从而发挥对大鼠LPS相关ALI的保护作用。
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　　（收稿日期：2019-07-22） （本文編辑：何玉勤）
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