黄芪对糖尿病肾病大鼠肾脏保护作用的探究*
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【摘要】 目的：观察不同剂量黄芪对链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病肾病（DN）大鼠肾脏保护作用。方法：选择50只健康雌性大鼠，随机选取10只作为正常对照组，然后将剩余40只大鼠用STZ诱导为糖尿病模型，并将其平均分为糖尿病组，黄芪低、中、高剂量组（腹腔分别注射5、15、30 g/kg）。干预12周末检测各组大鼠肾脏AngⅡ、ET-1含量，TGF-β1及PKC表达水平，大鼠尿液、血清及肾皮质中8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）含量及血清、肾皮质中肾皮质丙二醛（MDA）含量。结果：与正常组相比，糖尿病组MDA及8-OHdG含量与AngⅡ、ET-1、TGF-β1及PKC水平均较高（P<0.05）;与糖尿病组比较，黄芪各剂量组MDA、8-OHdG含量及AngⅡ、ET-1、TGF-β1及PKC水平均较低（P<0.05），其中以高剂量组改善最为明显（P<0.05）。结论：黄芪具有明显肾脏保护作用，可减轻糖尿病大鼠肾脏氧化应激损伤程度，且存在明显的剂量效应关系。
【关键词】 黄芪 糖尿病肾病 氧化应激 肾皮质丙二醛 8-羟基脱氧鸟苷
[Abstract] Objective： To investigate the protective value of Astragalus Membranaceus in the kidneys of diabetic rats induced by streptozotocin. Method： Totally 50 healthy female rats were enrolled， from which 10 rats were randomly selected as normal control group. Then the rest rats were induced to diabetic rat models by injections of streptozotocin （STZ）， and the successful models were divided randomly into four groups： the diabetes mellitus group， the low dosage Astragalus Membranceus group， the middle dosage Astragalus Membranceus group and the high dosage Astragalus Membranceus group. After 12 weeks of intervention， the biochemical test was used to measure the levels of TGF-β1， PKC， AngⅡ and ET-1. Other tests were done to measure the activity of superoxide dismutase the content of malondialdehyde （MDA） and 8-hydroxy-deoxyguanosine （8-OHdG） in the renal cortex. Result： The levels of TGF-β1， PKC， Ang Ⅱ， ET-1， MDA and 8-OHdG in the diabetes mellitus group were higher than those in the control group （P<0.05）. And the levels of TGF-β1， PKC， Ang Ⅱ， ET-1， MDA and 8-OHdG in the Astragalus Membranceus treatment groups were lower than those in the diabetes mellitus group （P<0.05）. The Astragalus Membranceus treatment high dose group improved most obviously than other groups （P<0.05）. Conclusion： The traditional Chinese herbal medicine Astragalus Membranceus have a protective value in the kidneys of diabetic， even inhibit the oxidative stress in the kidneys of diabetic rats with an obvious dose-effect relationship.
[Key words] Astragalus Membranceus Diabetic nephropathy Oxidation stress Malondialdehyde 8-hydroxy-deoxyguanosine
First-author’s address： Hankou Hospital of Wuhan City， Wuhan 430012， China
糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病疾病慢性进展的最常见且最严重的并发症之一，最终导致慢性肾功能衰竭，大多数患者因治疗无效而死亡[1]。其中氧化应激在DN的发生及发展中起着决定性作用[2]，故目前治疗手段多数以抗氧化为主。研究表明，黄芪可明显提高过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶活性，抑制细胞内氧化应激产物的生成[3]。本研究旨在用链脲佐菌素（STZ）诱导DN大鼠模型，探讨分别用不同剂量的黄芪对大鼠肾功能保护作用及抗氧化应激性影响，从而指导我们用中成药物治疗DN中提供理论依据。 1 材料与方法
1.1 实验动物
选择50只体质量约250 g且健康的雌性大鼠，由笔者所在医院动物实验室提供。
1.2 药物及试剂
黄芪颗粒（生产批号：1203011，规格：1 g/包，由生泰尔生物科技集团有限公司提供）。STZ由美国Sigma公司提供;肾皮质丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所）;8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）酶免试剂盒、糖化血红蛋白酶免试剂盒（上海研谨生物科技有限公司）;血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、人内皮素-1（ET-1）放射免疫试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司）;转化生长因子-β1（TGF-β1）、蛋白激酶C（PKC）酶联免疫试剂盒（上海通蔚实业有限公司）。
1.3 DN模型、分组及给药
50只中大鼠中随机选择其中10只作为对照组，然后切除剩余40只大鼠的左肾后禁食12 h后给予STZ 50 μg/g腹腔注射，给药72 h后若检测大鼠空腹血糖≥16.7 mmol/L表明建模成功[4]。将建模完成的40只大鼠平均分成四组，即糖尿病组，黄芪低剂量组、黄芪中剂量组、黄芪高剂量组;正常对照组及糖尿病组仅腹腔注射等渗的生理盐水，黄芪低、中、高剂量组分别腹腔注射黄芪5、15、30 g/kg，1次/d，连续12周。
1.4 标本采集及处理
第12周腹腔药物注射结束后，分别采集各组大鼠24 h 尿液、禁食12 h后在麻醉抽取静脉血液，离心后将血清标本保存于-20 ℃冰箱内，完善各项生化指标的检测。摘取大鼠双侧肾脏，取其右侧肾脏肾皮质用于测定MDA、8-OHdG及各项氧化应激指标。
1.5 指标检测方法
肾脏AngⅡ、ET-1含量采用放射免疫法测定，TGF-β1及PKC表达采用免疫组织化学染色法检测，MDA与8-OHdG的测定分别采用硫代巴比妥酸法及酶联免疫法。
1.6 统计学处理
本研究数据采用SPSS 17.0统计学软件进行分析和处理，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠肾脏AngⅡ、ET-1、PKC及TGF-β1水平
与正常组比较，糖尿病组及黄芪各治疗组AngⅡ、ET-1、PKC及TGF-β1水平均较高（P<0.05）;与糖尿病组比较，黄芪各治疗组AngⅡ、ET-1、PKC及TGF-β1水平均较低（P<0.05）。与黄芪低剂量组相比，黄芪中、高剂量组ET-1、PKC及TGF-β1及黄芪高剂量组AngⅡ水平较低（P<0.05）;而与黄芪中剂量组比较，黄芪高剂量组ET-1、TGF-β1水平较低（P<0.05），见表1。
2.2 大鼠MDA和8-OHdG水平
與正常组比较，糖尿病组及黄芪各治疗组MDA及8-OHdG水平显著较高（P<0.01）。与糖尿病组比较，黄芪各治疗组MDA和8-OHdG水平均较低（P<0.05）。与黄芪低剂量组比较，除外黄芪中剂量组肾皮质MDA水平外，余黄芪中、高剂量组MDA、8-OHdG水平均较低（P<0.05）;与黄芪中剂量组比较，黄芪高剂量组MDA和8-OHdG水平较低（P<0.05），见表2。
3 讨论
DN在中医领域归为水肿、消渴等范畴，而中成药黄芪具有利水消肿、补气升阳、活血化瘀，滋阴补肾，补气利水。研究证实，黄芪可利于糖尿病患者糖原合成及降低胰岛素抵抗，改善胰岛素的敏感性，使机体血糖维持稳定[5]。范颖等[6]通过对糖尿病模型大鼠氧化应激作用的研究表明黄芪具有抗氧化损伤、控制血糖、增强免疫耐受等多种药理作用。
最近研究观点认为高糖状态时氧化应激作用在DN进展中发挥重要作用。当肾组织氧化应激时，过多的氧自由基生成，与细胞膜磷脂不可逆性结合，导致脂质过氧化物储积。MDA属于脂质过氧化物之一，当肾组织氧化应激损伤时，机体MDA水平升高。8-OHdG作为DNA氧化损伤产物在DN的发病机制中起到重要作用。8-OHdG不能单独通过细胞内外的非DNA氧化损伤产生，且在尿中不受饮食及炎症因素干扰，故测定24 h尿8-OH dG含量可以作为观察DN的生化指标。张霞等[7]通过对入组的68名2型糖尿病患者研究发现，8-OHdG水平与DN病变程度呈正相关，这与本研究结果相一致。
Neuhofer等[8]研究表明，生物活性肽ET-1具有缩血管作用，促进肾小球内皮细胞增生，有利于细胞外基质的生成。高洁等[9]阐明生长因子TGF-β1与糖尿病肾病发病的发生发展呈密切相关，促进肾脏上皮细胞高度表达，并抑制其凋亡。TGF-β1与ET-1相互促进各自的基因表达上调，形成正反馈作用，最终两者过度表达致肾脏严重受损[10]。本实验结果示糖尿病组及各黄芪治疗组AngⅡ、ET-1及PKC、TGF-β1水平明显增加，腹腔注射黄芪后肾组织ET-1及TGF-β1水平下降，提示黄芪可以改善肾组织免受过度表达的ET-1及TGF-β1的破坏作用。PKC信号转导通路可以使TGF-β1表达上调，最终导致肾小球硬化和基质积聚而引起DN[11]，Manabe等[12]通过降低PKC的活性可以明显延缓DN的发生;本实验亦显示腹腔注射黄芪后肾组织PKC及TGF-β1表达下调，提示PKC同TGF-β1共同参与抗肾脏组织纤维化、保护肾脏的功能。
综上可知，黄芪具有明显改善糖尿病组大鼠肾功能，同时在肾组织抗氧化应激损伤中发挥重要作用，具有明显的剂量依赖关系。这在临床上黄芪治疗DN患者提供了重要的实验依据。
参考文献
[1]李翠琼.护理干预对糖尿病肾病患者遵医行为的影响[J].当代医学，2011，17（7）：127-128. [2] Brownlee M.The pathobiology of diabetic complications：a unifying mechanism[J].Diabetes，2005，54（6）：1615-1625.
[3]曹玲玲，李维祖，司秀莲，等.黄芪甲苷对肾小球系膜细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制[J].中国中药杂志，2013，38（5）：725-730.
[4] Sun H L，Sun L，Li Y Y，et al.ACE-inhibitor suppresses the apoptosis induced by endoplasmic retic-ulum stress in renal tubular in experimental diabetic rats[J].Exp Clin Endocrinol Diabetes，2009，117（7）：336-344.
[5]欧阳静萍.黄芪降血糖机制的研究[J].山东中医杂志，2005，24（11）：688.
[6]范颖，李新.黄芪部分有效部位对糖尿病模型大鼠氧化应激的影响及其交互关系 [J].中华中医药杂志，2014，29（11）：3432-3436.
[7]张霞，苏本利，王赞峰，等.尿8-羟基脱氧鸟苷水平与糖尿病肾病的相关性[J].中国糖尿病杂志，2006，14（1）：41-42.
[8] Neuhofer W，Pittrow D. Role of endothelin and endothelin receptor antagonists in renal disease[J].Eur J Clin Inves，2006，36（3）：78-88.
[9]高潔，范例，刘茂静，等.粉红胶霉菌对糖尿病大鼠肾组织TGF-β1、TIMP-1及PAI-1表达的影响[J].山东大学学报：医学版，2011，49（1）：14-18.
[10]陈建康，邹万忠，由江峰.内皮素对肾小球系膜细胞转化生长因子基因表达的影响[J].中华肾脏病杂志，1996，12（5）：285-288.
[11] Franckhauser S，Munoz S，Elias I，et al.Adipose overexpression of phosphoenolpyruvate carboxykinase leads to high susceptibility to diet-induced insulin resistance and besity[J].Diabetes，2006，55（2）：273-280.
[12] Manabe E，Handa O，Naito Y，et al.Astaxanthin protects mesangial cells from hyperglycemia-induced oxidative signaling[J].J Cell Biochem，2007，10（22）：1-3.
（收稿日期：2019-08-26） （本文编辑：郎序莹）
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