利用PCR法检测熟牛肉的肉源性
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作者:贾南南 李建平 范美霞
摘 要：本文旨在建立实时荧光PCR检测熟牛肉中牛、猪、马等动物源性成分的方法。通过对菏泽市市售熟牛肉进行采样检测，提取熟牛肉中总DNA后进行实时荧光PCR检测，确定Ct值，分析样品熟牛肉中牛、猪、马源性成分。通过检测DNA提取液（纯度1.6～1.7），便能满足实时荧光PCR的检测要求。本次采样检测的12批样品中，2批既检出牛源性成分又检出马源性成分，说明样本可能存在马肉掺假为牛肉的问题。
1 引言
随着社会的发展，人们的生活水平不断提高，对肉制品的要求也越来越高。但是，肉制品市场存在肉类掺假、以次充好等欺骗消费者的行为，不法商贩为了追求自身利益以“挂羊头卖狗肉”的方式用劣质肉冒充高质量的肉制品。利用常规的检测方法只能从感官及形态上鉴别肉类，无法从溯源层面解决肉类掺假的问题，例如对于腌制加工的熟牛肉，消费者就很难通过肉眼辨别其是否为牛肉。
随着分子生物学的发展，以DNA为基础的PCR技术被广泛应用于动物源性成分的检测[1-4]，即聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）溯源是以DNA遗传物质为基础鉴别肉及肉制品。聚合酶链式反应是一种在体外特异性扩增DNA序列的技术，其基本过程为3个阶段的多次循环——模板双链DNA的变性、引物与模板DNA的退火、在DNA聚合酶引导下的链延伸反应，且每一次循环后的扩增产物均可作为下一轮循环的模板。就理论而言，扩增产物量呈指数形式上升，即经过n个循环后，产物量增加到2n倍。此方法在动物源性成分检测、肉类掺假鉴别等应用上已有多个报道[7，8]。本研究针对菏泽市市场上销售的肉及肉制品进行抽样检测，利用实时荧光PCR方法鉴别牛、猪、马源性成分，以期发现是否存在掺假的情况，旨在为肉制品掺假检测提供一定的参考依据。
2 材料和方法
2.1 材料
12份市售熟牛肉。
2.2 仪器
绞肉机，小熊电器股份有限公司;金属浴，杭州奥盛仪器有限公司;Rotor Gene Q 荧光定量PCR仪，德国凯杰。
2.3 试剂
无水乙醇，天津市富宇精细化工有限公司;DNA提取试剂盒，天根生物公司;猪源性检测试剂盒、牛源性检测试剂盒，Takara公司;马引物及探针（SN/T3730.5-2013）、PCR体系预混液2xTaqMan Fast qPCR Master Mix（Probe qPCR），上海生工合成。
2.4 样品处理
取适量样品放入烧杯中，用温水冲洗并挤干水分，往复数次，用干净的绞肉机粉碎，备用。
2.5 样品总DNA提取
按照DNA提取试剂盒说明书进行操作。
2.6 DNA纯度与浓度
打开核酸蛋白检测仪，吸取 DNA溶解液2μL加入加样口，分别测定260nm与280nm吸光度，测定DNA提取液的浓度和纯度。
2.7 聚合酶链式反应（PCR）
2.7.1牛源性实时荧光PCR反应
以提取的各个DNA样品为模板，按牛源性检测试剂盒说明书操作。
2.7.2 猪源性实时荧光PCR反应
以提取的各个DNA样品为模板，按猪源性检测试剂盒说明书操作。
2.7.3 马成分检测
以提取的各个DNA样品为模板，作阳性对照、阴性对照、空白对照。
反应体系：2xTaqMan Fast qPCR Master Mix 10μL、10μM Forward Prime 0.4μL、10μM Reverse Primer 0.4μL、10μM probe 0.4μL、DNF Buffer 2μL、模板DNA 1μL、dH2O 5.8μL。
反应条件：预变性94℃3min，变性94℃5s，退火延伸60℃30s（收集荧光信号），40个循环。
3 结果与分析
3.1 DNA模板质量
所有样品DNA提取液OD260/OD280值为1.6～1.7，浓度为50～100ng/μL，模板DNA在纯度及浓度上都能够满足进行PCR检测的要求。
3.2 实时荧光PCR 检测结果
分别配制牛、猪源性荧光PCR反应体系和马成分荧光PCR反应体系，Ct值如表1所示。当样品的Ct值不为0且小于35，并有典型的扩增曲线时，则判定样品检出该动物源性成分;反之则为未检出该动物源性成分。
4 讨论
动物源性食品大多为动物组织，其结构紧密，富含蛋白质、脂肪等大分子物质，而熟肉制品在制作过程添加了入味调料等，这些物质会在DNA提取过程中产生共沉淀，倘若提取不当将会影响后续PCR检测。因此，在提取DNA的过程中，去除杂质，得到高DNA纯度尤为重要。本方法在前处理时用温水多次洗涤，去除入味的香料和盐等成分，DNA提取采用试剂盒介质吸附法（硅基质），DNA纯度高，杂质等抑制物少，是PCR成功的保证。检测结果显示，所抽取的市售12批样本中均检出牛源性成分，2批既检出牛源性成分又检出马成分，说明样本可能存在马肉掺假为牛肉的问题。
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