抗病小黑麦异染色体系的创制与鉴定

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　　摘要：黑麦属作为小麦的三级基因源，具有抗多种病害及耐逆性强等特性，是小麦遗传改良重要的近缘植物之一。本研究利用CIMMYT引进的六倍体小黑麦20090148与普通小麦材料复合杂交，从杂交后代中筛选出了四份遗传稳定、综合农艺性状优良的材料：127-12-2、134-5-1、131-2-3和125-3-1，对其抗病性等性状特点进行鉴定，并利用寡核苷酸探针套进行染色体原位杂交鉴定，以明确其遗传组成。结果表明127-12-2、134-5-1和125-3-1为小麦-黑麦渐渗系，131-2-3为代换系;通过将131-2-3与其亲本进行核型比对，发现其染色体组成。四份小黑麦材料的性状和遗传组成鉴定，将为它们在小麦遗传改良上的进一步应用奠定基础。
　　关键词：小黑麦;农艺性状;抗病性;染色体原位杂交
　　中图分类号：S512.403.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）05-0007-06
　　小麦（TriticumaestivumL.）作为我国三大粮食作物之一，其产量和品质直接关系到国家的粮食安全。培育高产优质小麦新品种，对于我国小麦产量稳定和粮食安全起着举足轻重的作用。小麦育种水平的高低很大程度上取决于掌握种质资源的数量、质量及对其研究的深度和广度[1]。但目前小麦品种遗传改良过程中，由于较长时期以来集中利用少数亲本材料，导致育成小麦品种的遗传多样性降低，产量和适应性难以突破[2];普通小麦中许多优良抗性基因逐渐失去抗性，小麦种内遗传资源日趋匮乏，已成为限制小麦遗传改良取得重大突破的重要瓶颈之一。
　　黑麦（Secalecereale，RR，2n=14）作为小麦的近缘物种，蕴藏着丰富的白粉病、叶锈病、条锈病和秆锈病等抗性基因，是小麦改良的重要基因资源。将黑麦抗病基因导入到小麦中，可以增强小麦抗性并改良小麦品质，对实现小麦高产高抗具有重要的现实意义。小黑麦是黑麦有益基因转入小麦形成的典型双二倍体，分为四倍体（AARR，2n=28）、六倍体（AABBRR，2n=42）、八倍体（AABBDDRR，2n=56）及十倍体（AABBDDRRRR，2n=70），在生产上利用最广泛、价值最高的属六倍体和八倍体小黑麦。六倍体小黑麦将小麦的早熟、品质优良与黑麦的耐逆境胁迫、抗病性强等特点结合在一起，是转移黑麦优良基因的桥梁材料。
　　利用黑麦基因资源改良小麦品种的最理想方式就是创制小麦-黑麦易位系。目前已报道了众多的小麦-黑麦易位系，但只有1RS/1BL易位被成功利用。2012年，毛勇以高感条锈病的小麦品种绵阳11（MY11）和免疫条锈病的白粒黑麦自交系后代杂交，检测到杂交后代中产生了新的高抗条锈病的小麦-黑麦1RS/1BL易位系[3];同年，贾举庆等将绵阳11与波斯小麦-非洲黑麦双二倍体杂交，在F6代筛选到大量新的易位系材料，并且其中有许多是渐渗系[4]。2013年，李宇新等利用小麦-黑麦二体代换系间杂交，发现可显著提高易位系产生的频率[5]。
　　外源遗传物质的有效转移与利用在相当大程度上依赖于对小麦背景中外源染色体或染色体片段的准确、快速、简便追踪及鉴定。本研究应用寡核苷酸探针套，对综合农艺性状较好的小黑麦-普通小麦杂交后代127-12-2、134-5-1、131-2-3和125-3-1进行荧光原位杂交（fluorescentinsituhybridization，FISH）与基因组原位杂交（genomicinsituhybridization）技术结合的鉴定，可以同时区分黑麦1R～7R染色体并构建小麦染色体和外源黑麦染色体的核型，极大地提高遗传材料的鉴定效率。
　　1材料与方法
　　1.1供试材料
　　供试材料为从CIMMYT引进的六倍体小黑麦20090148与多个普通小麦材料复合杂交得到的多份后代种质材料。对其中综合农艺性状较好且稳定遗传的四份种质材料127-12-2、134-5-1、131-2-3和125-3-1进行综合分析和鉴定。所用普通小麦亲本包括莱州137、济麦22（JM22）、SN224及SN4076-1等。以辉县红作为感病对照。
　　1.2试验方法
　　1.2.1农艺性状调查参照李立会等的《小麦种质资源描述规范和数据标准》[6]，对株高、穗长、芒、株型和穗型等主要农艺性状进行调查。
　　1.2.2抗病性鉴定（1）苗期白粉病抗性鉴定：在培养箱内接种白粉病E09菌种，设置培养箱相对湿度为60%，光照强度为60%，光周期为光照14h、黑暗10h，对应温度为20℃和18℃。在苗盘内以感病对照辉县红种植感染行，待第一片叶充分展开时，将白粉菌孢子接种到供试材料上，接种10～15d后，当辉县红充分发病时，参照盛宝钦（1988）[7]提出的0～4六级反应型分级标准调查抗病性，其中，0型指免疫;0;型指有坏死反应，叶片有枯死斑;1型指高抗;2型指中抗;3型指中感;4型指高感。
　　（2）成株期白粉病鉴定：在大田进行成株期白粉病抗性鉴定，种植辉县红作为感染行，待辉县红充分发病后，采集病菌抖撒在供试材料叶片上，同时借助感染行诱发感染，按照0～4六级分级标准调查抗病性。
　　（3）成株期条锈病鉴定：参照NY/T1443.1—2007《小麦抗病虫性评价技术规范》第1部分《小麦抗条锈病评价技术规范》，在小麦拔节期进行人工注射接种条锈混合病菌（条中32和条中33），以辉县红作为感病对照并种植感染行。待辉县红充分发病后，按反应型0～4六级分级标准调查抗病性。
　　（4）成株期叶锈病鉴定：供试材料成株期叶锈病的鉴定参照《小麦抗病虫性评价技术规范》第2部分《小麦抗叶锈病评价技术规范》，以辉县红作为感病对照并种植感染行，待辉县红充分发病后，按反应型0～4六级分级标准调查抗病性。
　　1.2.3荧光原位杂交首先参照Dolezel等[8，9]的方法，稍作改动，获得根尖有丝分裂中期染色体制片;然后利用略微调整的寡核苷酸探针套[10]进行原位杂交，在同时进行寡核苷酸探针套FISH和GISH时，将pSc119.2-1的修饰改为TAMRA，以便与绿色基因组探针区别。并参考Zhuang等[11]描述的FISH程序，在杂交液中额外加入黑麦基因组DNA探针2.5μL和YN15基因组DNA1.7μL作为封阻。原位杂交时，在105℃加热1min，取出后迅速置于-20℃冰乙醇10min以上;期间将制片置于70%乙醇+NaOH中，24℃變性6min，迅速依次置于70%、95%、100%乙醇，各脱水3min，用吸耳球吹干;杂交液和片子均变性完成后，将杂交液滴到盖玻片的分裂相上，于37℃恒温箱杂交6h以上，复染并镜检。 　　2结果与分析
　　2.1农艺性状调查及抗病性鉴定
　　在六倍体小黑麦20090148与多个普通小麦材料复合杂交后代中，筛选到综合表现较好的四份材料：127-12-2、134-5-1、131-2-3和125-3-1，对其进行田间成株期农艺性状调查。四份材料平均株高最高的为134-5-1，最低的为127-12-2，株型均为中间型，且有芒，穗型分为长方穗、棍棒穗和圆锥穗三种类型，除134-5-1外均抗倒伏（图1和表1）。
　　间白粉病、田间条锈病及田间叶锈病均表现免疫、高抗或中抗，可以作为抗病材料选育的种质资源。
　　2.2细胞学鉴定结果
　　本研究利用改进的染色体原位杂交技术，通过一次细胞学实验，同时获得GISH与FISH两次实验的结果，不仅极大地优化了实验效率，而且可以明确所鉴定材料中外源黑麦染色体的具体同源群、核型以及普通小麦的染色体核型。
　　结果（图3）显示，四份小黑麦种质系材料的染色体数目均为2n=42条，其中127-12-2、134-5-1和125-3-1中未检测到较大片段外源染色体，推测为小麦-黑麦渐渗系材料;131-2-3虽然染色体为42条，但是出现2D染色体被2R染色体取代的现象，为2D/2R代换系。
　　在细胞学结果获得的基础上，构建了127-12-2、134-5-1、131-2-3和125-3-1的核型，见图4。对种质系131-2-3的小黑麦亲本20090148、普通小麦亲本SN224和济麦22也分别进行了原位杂交鉴定，构建染色体核型，并将三个亲本材料的染色体与131-2-3的染色体进行核型比对，结果（图5）显示，除2R代换了普通小麦的2D染色体外，131-2-3中的6A、1B和2B染色体与三个亲本染色体上的信号位点均出现了差异，表明131-2-3染色体结构发生了较大的变异。
　　3讨论与结论
　　小黑麦异染色体系的创制是黑麦中优异基因向普通小麦转移的主要途径，它的创制为优良种质材料的选育及进一步明确抗病来源及基因定位创造了条件。作为重要的白粉病抗源，小黑麦异染色体系已经被发掘出多个白粉病抗性基因。例如：最早在小麦-黑麦易位系品种Transec中发现的Pm7基因，来自黑麦Rosen;携带位于1RS上的Pm8基因的易位系被广泛种植;利用X射线处理得到的1AL/1RS易位系Amigo，含有位于1RS上的Pm17基因以及最早在6BS/6RL易位系MIP6中发现的Pm20基因[12]。
　　同时，对于黑麦条锈病抗性基因的挖掘也是从选育小黑麦异染色体系开始的。已正式命名的小麦条锈病抗性基因中，Yr9基因[13]源于德国黑麦Petkus，此外，2010年赵毓将小麦-奥地利黑麦双二倍体与阿勃6B缺体系杂交，筛选出了对白粉病和条锈病皆免疫的6R/6A代换系[14];2011年，张怀琼等选育了高抗条锈病的小麦-黑麦6B/6R易位系，确定条锈病抗性来自6R易位片段[15];2013年，雷孟平在小麦-非洲黑麦双二倍体与小麦杂交后代中筛选出免疫条锈病的6R/6D代换系[16]，综合以上材料选育的结果，可以说明6R染色体上可能携带新的条锈病抗性基因。
　　此外，叶锈病抗性基因Lr45是在一个日本小麦-黑麦T2AS-2RS·2RL易位系中被发现的，来自黑麦Petkus，位于2RS上，是我国小麦叶锈菌的有效抗性基因，尚未发现对Lr45基因有毒性的叶锈菌株，在小麦育种中具有很大的应用潜力。
　　通过染色体工程和基因工程等方法对小黑麦异染色体系进行改良选育优良材料并研究黑麦染色体抗性基因，对于拓宽小麦的基因资源，培育高产优质小麦品种起着至关重要的作用。本研究通过表型鉴定及细胞学检测的手段，获得了127-12-2、134-5-1、131-2-3和125-3-1四份优异小黑麦异染色体系材料，可用于进一步创制优良育种材料。
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