凤丹牡丹多酚提取及其抗氧化活性研究

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　　摘要：为提高凤丹牡丹（Paeonia suffruticosa Fengdan）葉的多酚提取率，采用纤维素酶法提取叶中的多酚，以多酚提取量为考察指标，在单因素试验的基础上，选取纤维素酶用量、酶解温度、酶解时间、pH 4个因变量，进行响应面试验，建立各因变量与响应值之间的数学模型，确定最佳提取工艺条件。结果表明，曲面回归方程拟合性良好，其中纤维素酶用量和酶解温度的交互作用显著，得到多酚的最优工艺条件为纤维素酶用量150 U/mL、pH 5.0、酶解温度50 ℃、酶解时间105 min，在此条件下，多酚提取量达到34.66 mg/g，与模型预测值35.10 mg/g接近。凤丹叶片提取液对DPPH·清除率在提取液浓度为0.06 mg/mL时达到82.15%;对·OH清除率在提取液浓度为0.32 mg/mL时达到27.10%;铁氰化钾还原力在提取液浓度为10 mg/mL时，吸光度为3.41。
　　关键词：凤丹牡丹（Paeonia suffruticosa Fengdan）;多酚;酶法提取;响应面设计;抗氧化活性
　　中图分类号：S567.1+5         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2019）24-0187-07
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.24.046           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Determination of in vitro antibacterial activity of antioxidant and
　　the extraction of Fengdan peony polyphenols
　　LI Pei-xuan，CHEN Fa-zhi，LI Xiu-li，JI Xiao-mei，CHEN Zhi-wei，ZHAI Jing-hua
　　（Institute of Forestry and Fruit Tree，Wuhan Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430075，China）
　　Abstract： In order to improve the comprehensive utilization rate of peony（Paeonia suffruticosa Fengdan） leaf of Fengdan resources， the polyphenols in the leaves of peony were extracted by cellulase method， and the polyphenols were used as the index. The effects of cellulase concentration， enzymatic hydrolysis temperature， enzymatic hydrolysis time and pH value on the extraction of polyphenols in peony leaves were investigated by response surface. The results showed that the best condition for extraction of polyphenols from peony leaves by cellulase was： when the concentration of cellulase was 150 U/mL， the pH was 5.0， the enzymatic time was 105 min， the temperature of enzymatic hydrolysis was 50 ℃. Under this condition， the theoretical prediction value of polyphenol content was 34.66 mg/g. The antioxidant activity of the best condition for extraction was examined. The DPPH· scavenging abilities of Fengdan leaf extract reached 82.15% when the extract concentration was 0.06 mg/mL; the hydroxyl scavenging abilities reached 27.10% when the concentration was 0.32 mg/mL;reducing abilities of the potassium ferricyanide absorbance was 3.41， when the concentration of the extract was 10 mg/mL.
　　Key words： Fengdan peony（Paeonia suffruticosa Fengdan）; polyphenols; enzyme extraction; design of response surface; dntioxidant activity
　　牡丹（Paeonia suffruticosa）代表着富贵，外形美丽，具有“花中之王”之称，有较高的经济、观赏价值[1]。凤丹牡丹是由牡丹野生原种杨山牡丹经过长期栽培演化形成的观赏、食用兼药用的品种群，是中国油用牡丹栽培的主要类型，在山东、河南、河北、陕西、安徽、湖北、四川、江苏、湖南等省广泛栽培。凤丹牡丹的花、果实、根、叶均具有较高的开发利用价值，凤丹牡丹子油、花先后被国家卫生健康委员会批准为新资源食品。牡丹的花、叶中含有大量的酚类物质，具有提高免疫功能、抗心血管疾病、抗炎、抗肿瘤等多种生物药理活性[2-4]，在化妆品、食品添加剂等领域具有良好的开发应用前景[5]。史国安等[6]、吴龙奇等[7]、刘建华等[8]研究对比了不同种类的牡丹花、叶中营养成分，发现其均含有大量的多酚类物质、矿物质、微量元素及氨基酸等，且具有较强的抗氧化活性。 　　多酚类物质是植物中常見的一种成分，主要包括类黄酮、酚酸、花青素等物质，具有抗氧化、预防心血管疾病、抗炎抑菌、降血压等功效，有人类健康卫士之称[9-11]。国内外关于多酚的提取方法有溶剂提取法（Solvent Extraction，SE）、微波提取法（Microwave Assisted Extraction，MAE）、超声辅助提取法（Ultrasound Assisted Extraction，UAE）、超临界流体提取法（Supercritical Fluid Extraction，SFE）、酶法提取（Enzyme Extraction，EE）等[12]。与有机溶剂提取、超声辅助提取以及微波提取在规模化生产时的局限性相比，酶法提取具有对提取设备要求低、反应温和、反应过程简单等优点[13]。近年来，酶法提取已被广泛应用于生物活性物质的提取和研究中，而关于凤丹牡丹多酚提取的研究鲜见报道。因此，本研究采取酶法提取凤丹牡丹叶中多酚物质，并通过响应面优化得到最优的工艺条件，为凤丹牡丹资源综合利用提供科学依据。
　　1  材料与方法
　　1.1  试验材料
　　1.1.1  材料  凤丹牡丹叶采于2017年6月，采自武汉市农业科学院林业果树研究所郑店基地种植的5年生凤丹牡丹实生苗木。
　　1.1.2  试剂  没食子酸标准品，购自上海源叶生物科技有限公司;纤维素酶，购自日本Yakult工业股份有限公司;二苯代苦味酰基自由基（DPPH）， 购自美国Sigma公司;其他试剂未加说明均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
　　1.2  仪器设备
　　ME203E型电子天平，i8型双光束紫外/可见分光光度计，EMS-50-双列十孔恒温水浴锅，TGL-20M高速离心机，TGCXN-2B超声循环提取机。
　　1.3  试验方法
　　1.3.1  凤丹牡丹叶纤维素酶解处理与提取  取新鲜的凤丹牡丹叶，洗净后自然晾干水分，50 ℃下真空干燥24 h，粉碎成粉末状，备用。取已粉碎牡丹叶片粉末1 g，在不同工艺下进行酶解后离心，保留上清液，对沉淀物进行水提（料液比1∶20，温度50 ℃，搅拌1 h）后离心，混合2次上清液，定容至100 mL。
　　1.3.2  多酚含量的测定  多酚含量的测定参照张亮亮等[14]的方法，求得回归方程为y=7.64x+0.254，R2=0.991 3。
　　1.3.3  单因素试验
　　1）纤维素酶用量的选择。准确称取已处理好的1 g凤丹牡丹叶粉末，分别加入浓度为50、100、150、200、250 U/mL的纤维素酶溶液1 mL，在酶解温度50 ℃、pH 5.0的条件下酶解100 min，测定不同纤维素酶用量对多酚提取量的影响。
　　2）pH的选择。准确称取已处理好的1 g凤丹牡丹叶粉末，加入浓度150 U/mL的纤维素酶溶液1 mL，在酶解温度50 ℃条件下，分别在pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的条件下酶解100 min，测定不同pH对多酚提取量的影响。
　　3）酶解时间的选择。准确称取已处理好的1 g凤丹牡丹叶粉末，加入浓度150 U/mL的纤维素酶溶液1 mL，在酶解温度50 ℃、pH 5.0的条件下分别酶解40、60、80、100、120 min，测定不同酶解时间对多酚提取量的影响。
　　4）酶解温度的选择。准确称取已处理好的1 g凤丹牡丹叶粉末，加入浓度150 U/mL的纤维素酶溶液1 mL、调节pH至5.0，分别在40、45、50、55、60 ℃温度下提取100 min，测定不同酶解温度对多酚提取量的影响。
　　1.3.4  响应面试验  根据单因素试验结果，通过Design-Expert 7.0软件进行响应面优化设计，以多酚提取量（Y）为响应值，以酶用量（A）、pH（B）、酶解时间（C）、酶解温度（D）为因变量，设计4因素3水平的响应面试验，因素与水平见表1。
　　1.3.5  DPPH自由基清除率的测定  参照赵鑫等[15]的方法，将原液浓度调整为0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL。
　　1.3.6  羟基自由基清除率的测定  参照陈佳龄等[16]的方法，将加入原液的量调整为稀释10倍后的原液0.16、0.20、0.24、0.28、0.32 mL。
　　1.3.7  铁氰化钾还原力的测定  参照秦建华等[17]的方法，吸光度越高，代表还原力越强。
　　2  结果与分析
　　2.1  纤维素酶法提取凤丹牡丹多酚的单因素试验结果
　　2.1.1  酶用量对凤丹牡丹叶多酚提取量的影响  由图1可知，在考察浓度范围内，多酚提取量随纤维素酶用量的增加呈先增大后减小的趋势，当酶用量为150 U/mL时，多酚提取量最大。其原因主要为酶用量增加会加快酶促反应速率，细胞壁裂解加速，多酚物质溶出;但当底物饱和时，酶促反应达到平衡，且酶蛋白分子的聚集也阻碍了细胞内物质的扩散。因此，选取酶的最适用量为150 U/mL。
　　2.1.2  pH对凤丹牡丹叶多酚提取量的影响  由图2可知，随着反应体系pH增大，多酚提取量呈先升高后下降趋势，当pH为5.0时，多酚提取量达到最大。原因可能是pH对酶活影响较大，酶在适宜的pH下活力最强，相反pH过高或过低都会影响酶活。因此，选取最适pH为5.0。
　　2.1.3  酶解时间对凤丹牡丹叶多酚提取量的影响  由图3可知，在考察时间范围内，随着酶解时间的延长，多酚提取量呈上升趋势，当反应时间为100 min时，多酚提取量开始呈缓慢下降趋势。其原因可能随着酶解时间的延长，细胞内多酚物质可以充分溶出，但时间过长会导致多酚类物质被氧化。因此，选取最适的酶解时间为100 min。 　　2.1.4  酶解温度对凤丹牡丹叶多酚提取量的影响  由图4可知，随着酶解温度的增加，多酚提取量呈先升高后降低趋势，当酶解温度为50 ℃时，多酚提取量达到最大。随着温度的增加，酶活增强，反应速率加快，且多酚物质溶解度得到提高;但随着温度继续增大，酶活性被抑制，而且可能部分多酚物质被氧化。因此，选取最适酶解温度为50 ℃。
　　2.2  响应面试验
　　2.2.1  响应面试验结果  利用Design-Expert 7.0软件的Box-Behnken进行响应面设计，以酶用量（A）、pH（B）、酶解温度（C）、酶解时间（D）为响应变量，以多酚提取量（Y）为响应值，进行响应面试验，结果如表2所示，对表2中的数据进行多元二次回归拟合，建立提取工艺参数的回归模型。回归方程为：Y=34.45+0.11A+1.07B+4.01C+0.50D-0.66AB-0.032AC-4.55AD+0.95BC-0.62BD-0.78CD-3.82A2-6.14B2-7.01C2-4.48D2。
　　由表3、表4中可知，二次回归模型的F值为12.593 29，该模型达到了极显著水平（P<0.01）;失拟项是模型中数据的变异，失拟项P=0.104 4大于0.05，说明失拟项差异不显著，验证无失拟因素存在，能够反映实际情况，回归模型是合理的。模型决定系数R2为0.926，说明多酚提取量的结果与模型预测结果有良好的一致性。试验模型的校正系数R2adj为0.853，说明试验结果有85.3%受试验因素的影响，模型拟合良好;变异系数（Coefficient variability，CV）表示不同水平的处理组之间的变异程度。模型变异系数为8.48%，变异小，说明模型的可信度高，可重复性较好。信噪比（Adeq precision）是表示信号与噪声的比例，通常希望该值大于4。该模型中信噪比为11.070，说明模型的充分性和合理性，模型具有足够高的精确度，能准确地反映试验结果。
　　2.2.2  响应面分析  响应面图是反映各响应值间交互作用的3D曲面图，可直观观察到各因素对响应值影响大小，根据响应面试验得到的3D曲面图如下图5至图10所示。C2、B2、C、D2、A2、AD对多酚提取量影响在0.01水平显著，从F值大小可见，对多酚提取量影响由大到小是C2、B2、C、D2、A2、AD，说明试验因素对多酚提取量的影响不是简单的线性关系，二次方的影响较大，同时AD还存在交互作用，C存在线性效应。本试验所选因素对响应值影响存在二次方效应和线性效应以及交互效应，在各因素的取值范围内，最大均值差C>B>D>A，波动图C>B>D>A，总体上对多酚提取量影响大小为C>B>D>A。
　　2.3  验证试验
　　通过软件Design-Expert进行工艺参数的优化组合，得到多酚提取的最优工艺条件为纤维素酶用量149.34 U/mL，pH 5.05，酶解时间105.83 min，酶解温度为50.30 ℃，在此条件下，多酚含量提取量最大，多酚含量的理论预测值为35.10 mg/g。为验证响应面法优化试验结果的可靠性，考虑到实际操作，将最佳工艺条件优化为纤维素酶用量150 U/mL、pH 5.0、酶解温度50 ℃、酶解时间105.8 min，在此条件下进行3次平行验证试验，得到平均多酚提取量为34.66 mg/g，实际测量值与理论预测值吻合度为98.74%，接近模型预测值，说明利用响应面分析法优化凤丹牡丹叶多酚提取条件和数值是可靠的。
　　2.4  抗氧化活性
　　2.4.1  对DPPH·的清除作用  自由基几乎可以在任何惰性条件下和任何惰性物质发生反应[18]。自由基对人体健康的危害，并与许多疾病有着直接的或潜在的联系，如与癌症、衰老、各种心血管疾病、帕金森综合症等各种急性和慢性疾病密切相关[19]。DPPH又称1，1-二苯基-2-2-苦肼基DPPH·，1959年DPPH法被提出，比色测定简便高效，由于DPPH·半衰期较长使其具有较好的重现性，通常被用于检测酚类物质、脂肪族硫醇类和食品的抗氧化能力等[20]。由图11可见，凤丹葉片提取液对DPPH·清除率呈剂量依赖关系，清除率随提取液浓度的上升而增加，在浓度为0.05～0.06 mg/mL时趋于稳定，在0.06 mg/mL时，清除率最高，达到82.15%，表明凤丹牡丹叶提取物清除DPPH·的能力较强。
　　2.4.2  对·OH的清除作用  ·OH是活性氧中反应能力最强的自由基之一，它几乎可以和细胞内的一切有机物反应，能杀死红细胞，降解细胞膜、DNA和多糖类化合物，引起组织细胞病变，导致疾病发生和加速机体衰老[21]。由图12可见，凤丹牡丹叶提取液对·OH清除率存在剂量依赖关系，随提取液浓度的上升而增加，在浓度为0.24～0.32 mg/mL时趋于稳定，在浓度为0.32 mg/mL时，清除率达到最高，为27.10%，表明凤丹叶提取物清除·OH的能力不强。
　　2.4.3  铁氰化钾还原力  铁氰化钾是一种有毒的氧化剂，常存在于漂白剂、腐蚀剂中[22]。从图13中可见，凤丹叶提取液对铁氰化钾还原力随提取液浓度的上升而增强，在浓度为10 mg/mL时，吸光度达到最高，为3.41，表现出较强的铁氰化钾还原力。
　　3  结论
　　以凤丹牡丹叶为研究对象，采用纤维素酶提取其多酚物质，在单因素试验基础上，选取纤维素酶用量、pH、酶解时间和酶解温度4个因变量进行Box-Behnken试验设计，使用Design-Expert 7.0软件进行数据拟合，建立了提取工艺的二次多项数学模型，该模型达到了极显著水平，拟合良好，各因素对凤丹叶多酚提取量影响由高到低为酶解时间>pH>酶解温度>酶用量。综合回归模型分析和验证试验，丹凤牡丹多酚酶法提取的最佳工艺为纤维素酶用量为150 U/mL、pH 5.0、酶解温度50 ℃、酶解时间105 min，在此条件下，多酚含量提取量达到34.66 mg/g，与模型理论预测值35.10 mg/g相近。以DPPH·清除率、·OH清除率、铁氰化钾还原力3种指标作为评价指标，对凤丹叶片酶法提取物进行抗氧化活性评价。结果表明，凤丹叶片提取液对DPPH·清除能力较强，在提取液浓度0.06 mg/mL时，·OH清除率最高，可达到82.15%，对·OH清除能力一般;对铁氰化钾还原力较强，在提取液浓度为10 mg/mL时，吸光度为3.41。 　　参考文献：
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