防治辣椒疫病的生防菌培养条件优化与菌剂复配

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　　摘要    为研制对辣椒疫病具有明显防治效果且田间稳定性好的生防菌剂，采用正交试验设计优化了美丽短芽孢杆菌NF2、多黏类芽孢杆菌J和枯草芽孢杆菌Q14的培养条件，并进一步筛选了3种芽孢杆菌组成的复合生防菌剂配比方式。结果表明，在优化后的培养条件下，3种芽孢杆菌的活菌数均可稳定在2.0×108 CFU/mL以上，当菌株NF2、J和Q14的活菌数分别为1.0×108、1.0×107、1.0×106 CFU/mL，按照1∶1∶1体积比配比制备时，与清水对照相比，复合生防菌剂可促进辣椒增产39.2%，对辣椒疫病的防效大于70%，并可在根际土壤中稳定存活和繁殖100 d以上。
　　关键词    辣椒疫病;芽孢杆菌;复合生防菌剂;培养条件;复配
　　中图分类号    S939.92        文献标识码    A
　　文章编号   1007-5739（2020）02-0084-03                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）
　　辣椒疫病俗称“死秧病”，是由辣椒疫霉（Phytophthora capsici）引起的一种具有毁灭性的土传病害，其發病周期短、发病率高，是辣椒产区的主要常见病害，并可在黄瓜、番茄、西瓜等多种作物中侵染传播[1-2]。目前，生产上主要采用抗病品种选育、耕作措施改良以及施用化学药剂等方法来进行病害防治，尽管具有一定的防治效果，但是受农药残留、生产成本高等因素的影响，目前仍需要探索高效、环保的绿色防控技术[3-4]。
　　近年来，国内外学者已经筛选了不同种类的细菌、放线菌、真菌用于辣椒疫病防治。生防菌可通过代谢产生抑菌活性物质、与病原菌产生拮抗作用等方式达到防病促生的作用，且由于其对环境无污染、无耐药性等优点，具有广阔的应用前景[5-6]。但是生防菌在田间的稳定性和菌株的定殖能力是影响其稳定发挥生防效果的重要因素。因此，有必要进一步研发抗逆性好、防效稳定的复合生防菌剂。
　　鉴于此，本文通过优化3种生防芽孢杆菌的培养条件、优化不同菌株配比方式，以期获得具有较高活菌数、产芽孢抗逆性好的复合生防菌剂，充分发挥多种生防菌协同抗病的优势，保证生防菌剂在田间发挥稳定的防效。
　　1    材料与方法
　　1.1    试验地点
　　试验在陕西省科学院渭南科技示范基地（陕西省渭南市大荔县）的温室大棚进行。
　　1.2    试验材料
　　试验菌种有美丽短芽孢杆菌NF2、枯草芽孢杆菌Q14，为本实验室保藏菌种;多黏类芽孢杆菌J，由西北大学生命科学学院分子微生物学实验室馈赠。
　　基础培养基：牛肉膏蛋白胨营养琼脂[7]、GB培养基[8]、PDA培养基[7]，均按照文献中描述的方法配制。
　　试验仪器有电热恒温培养箱（DHP-9402，上海一恒科技有限公司）、恒温摇床（QYC-200，上海新苗医疗器械制造有限公司）、离心机（GL-20M，上海卢湘仪离心机仪器有限公司）、生物显微镜（BX41-32P02，奥林巴斯）等。
　　1.3    试验方法
　　1.3.1    菌株Q14、J和NF2的培养条件优化。试验前期已经初步确定了3种芽孢杆菌的最佳培养温度、pH值和接种时间。本试验主要对菌株发酵培养基成分中的氮源、碳源、无机盐进行正交分析[9]和优化，以期获得较高活菌数的发酵产品。
　　（1）菌株Q14的最佳培养条件。试验根据无机盐、N源、C源添加量的不同，设9个处理，具体如表1所示。
　　（2）菌株NF2的最佳培养条件。试验根据无机盐、N源、C源添加量的不同，共设9个处理，各处理的无机盐、N源、C源的添加量同菌株Q14，具体如表1所示。
　　（3）菌株J的最佳培养条件。试验根据无机盐、N源、C源的不同，共设16个处理，具体如表2所示。
　　1.3.2    3种不同芽孢杆菌的复配。将3种芽孢杆菌的发酵液稀释为不同活菌数，按照1∶1∶1的体积比进行配比，采用3因素3水平正交分析的方法，设计3种不同芽孢杆菌配比方案，制备复合生防菌剂，另设清水对照处理。具体设计方案如表3所示。
　　1.3.3     复合生防菌剂的生防效果及田间稳定性分析。小区试验在温室大棚进行，试验共设3个处理，即处理T：将不同配比的复合生防菌剂施用于辣椒苗，并全部回接辣椒疫霉进行侵染;CK1：不施用生防菌剂，施用清水，但被辣椒疫霉侵染;CK2：既不施用生防菌剂，也不侵染病菌。3次重复，小区面积27 m2（3.6 m×7.5 m）。统计复合生防菌剂的生防效果并对其田间稳定性进行分析[10]。
　　2    结果与分析
　　2.1    菌株Q14的最佳培养条件
　　在30 ℃、培养时间48 h、摇床转速200 r/min的条件下，采用L9（33）正交试验分析，结果如表4所示。可以看出，处理4（营养成分为NaCl 5 g/L、牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、玉米粉20 g/L，pH值7.0～7.2）菌株Q14的活菌数最高。然而，由于在实际操作过程中，玉米粉难溶于水，发酵前首先需要将玉米粉进行糖化，增加生产成本。因此，在发酵过程中用葡萄糖10 g/L替换了玉米粉20 g/L，3次重复试验结果显示，活菌数也可达到 2.5×109 CFU/mL，与添加玉米粉20 g/L碳源培养结果无显著性差异。最终确定菌株Q14的最佳培养条件为NaCl 5 g/L、牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖10 g/L，pH值7.0～7.2，培养温度30 ℃，培养时间48 h，产芽孢率可达90%。 　　2.2    菌株NF2的最佳培养条件
　　在30 ℃、培养时间48 h、摇床转速200 r/min条件下，采用 L9（33）正交试验分析，结果如表5所示。可以看出，处理7（营养成分为 MgSO4 0.2 g/L、牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖10 g/L，pH值7.0～7.2）菌株NF2的活菌数最高，可达4.0×109 CFU/mL，3次重复验证结果一致，培养72 h后菌株NF2的产芽孢率可达90%。
　　2.3    菌株J的最佳培养条件
　　在30 ℃、培养时间48 h、摇床转速200 r/min条件下，采用L16（43）正交试验分析，结果见表6。可以看出，处理4（營养成分为NaCl 5 g/L、尿素5 g/L、蛋白胨10 g/L、淀粉15 g/L，pH值7.0～7.2）菌株J的活菌数最高，可达2.6×108 CFU/mL以上，3次重复验证结果一致，培养48 h后菌株J的产芽孢率可达100%。
　　2.4    生防菌剂复配条件优化
　　将3种不同的芽孢杆菌配制成不同活菌数的菌液，采用L9（33）正交试验分析，辣椒产量结果如表7所示。可以看出，当菌株NF2、J和Q14的活菌数分别为1.0×108、1.0×107、1.0×106 CFU/mL、按照1∶1∶1体积配比时，能显著提高辣椒植株产量，每株辣椒的产量达到0.394 kg，折产约24 t/hm2，与清水对照组（单株产量0.283 kg，折合产量17 205 kg/hm2）相比，约增产39.2%，3次重复验证结果一致，确定处理8为复合生防菌剂的最佳配比。
　　2.5    复合生防菌剂的生防效果及田间稳定性
　　由表8可知，与CK1相比，处理T相对防效可达70.4%，病情指数为17.0，显著降低。施用复合生防菌剂100 d后，对辣椒根际芽孢杆菌进行分离筛选，结果显示，与CK1相比，芽孢杆菌的活菌数提高近1倍，说明该复合生防菌剂在根际土壤中可存活、繁殖，田间稳定性较好。
　　3    结论与讨论
　　本试验通过采用正交统计分析方法，确定了菌株NF2、J和Q14的最佳培养条件，为制备具有较高活菌数和产芽孢率的生防菌剂奠定了基础。通过对复配条件进行优化，确定当菌株NF2、J和Q14的活菌数分别为1.0×108、1.0×107、1.0×106 CFU/mL时，按照1∶1∶1的体积比配比制备的复合生防菌剂能显著促进辣椒产量，对辣椒疫病具有明显的防效，并可在根际土壤中稳定存活和繁殖。
　　复合生防菌剂的优势在于能够避免单一菌剂在田间稳定性差的缺陷，充分发挥多菌株协同作用，进一步加强和稳定田间防效。目前，已有多篇报道证明了复合生防菌剂的生防效果，充分说明了复合生防菌剂是未来微生物制剂应用的趋势[11-12]。本试验结果为复合生防菌剂配制提供了理论基础，后续将进一步开展生防机理和大田试验研究，以推动生防菌的应用。
　　4    参考文献
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