盐胁迫对热带假丝酵母菌株GY8降酚性能的影响

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　　摘    要：本文旨在检测不同浓度氯化钠胁迫对高效降酚菌热带假丝酵母菌株GY8降解苯酚性能的影响。通过在含有0.1，10，25，50，100 g·L-1氯化钠的无机盐培养基中培养GY8菌，检测不同氯化钠浓度胁迫对菌OD600值、降解苯酚速率，降酚关键酶的活性的影响。结果表明，GY8菌在含0～100 g·L-1盐浓度培养基中均可生长，且都有降酚活性。但随着盐浓度增加，GY8菌OD600值和降酚速率及邻苯二酚1， 2-双加氧酶酶比活力均呈现抑制趋势，苯酚羟化酶的活性先增强后抑制。当氯化钠浓度超过25 g·L-1时，抑制作用明显增强。通过本研究可以得出GY8菌可耐受0～100 g·L-1氯化钠，且氯化钠对GY8降酚活性具有梯度抑制作用。
　　关键词：降酚性能;热带假丝酵母菌;氯化钠;苯酚羟化酶;邻苯二酚双加氧酶
　　中图分类号：Q93            文献标识码：A           DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.03.003
　　Effect of Salt Stress on the Phenol Degradation of Candida tropicalis GY8
　　LYU Jianhua， LI Hong， QU Wenhao， JIA Zhouying， XUE Zhiquan
　　（College of Life Science，Shanxi Agricultural University，Taigu， Shanxi  030801，China）
　　Abstract：The aim of this study was to investigate the influence of different concentration of sodium chloride stress on phenol-degrading activity of Candida tropicalis GY8. GY8 strain were cultured in the inorganic salt medium containing 0.1， 10， 25， 50 and 100 g·L-1 sodium chloride. The effects of different concentrations of sodium chloride on the OD600 value， the phenol-degrading rate， and the key enzyme activities for phenol degradation were detected. The results showed that GY8 strain could grow in the culture medium containing 0～100 g·L-1 salt concentration， and all of them had the activity of phenol degradation. However， with the increase of salt concentration， the OD600 value， the phenol-degrading rate and the specific activity catechol 1， 2-dioxygenase of GY8 strain showed inhibitory trend. The activity of phenol hydroxylase increased first and then inhibited. When the concentration of sodium chloride was more than 25 g·L-1， the inhibition was obviously enhanced. This study concluded that GY8 strain can tolerate 0～100 g·L-1 salt concentration， and NaCl has a gradient inhibitory effect on the phenol-degrading activity of GY8.
　　Key words： phenol degradation; Candida tropicalis; sodium chloride; phenol hydroxylase; catechol 1， 2-dioxygenase
　　苯酚及其衍生物作为重要的有机化工原料，主要用于生产酚醛树脂、烷基酚以及水杨酸等，被广泛应用于石油化工、医药、印染、造纸等行业[1-2]。在苯酚的制备和使用过程中都会使大量苯酚随着工业废水被排放，从而对环境造成影响。因此，含酚废水在排放时要进行预处理。
　　对于废水中苯酚的处理可利用物理、化学和生物处理方法，但由于生物处理具有高效、经济和环保效果而备受关注。近20年来，许多学者已經对生物降解苯酚进行了尝试。研究表明，许多微生物能够耐受低浓度的苯酚，并且将酚类化合物分解代谢成无害的最终产物，因此，利用微生物处理含酚废水是非常有效的方法[3-4]。
　　采用微生物降解工业废水中的苯酚时，其降解效果会受到许多因素的影响。目前，国内外在制备苯酚时，为了提高产量，常常加入大量含钙、镁、氯化钠等无机盐催化剂，从而使后期废水中常同时含有苯酚以及高浓度的盐分[5]。已有研究表明在采用活性污泥法处理废水时，盐度可以调控污泥的脱水性能，因此，常在活性污泥中加入一定的氯化钠来提高污泥的固含量[6]。但氯化钠的浓度太高会对微生物的生长产生抑制作用[7-9]。因此，为了使微生物能够更好地生长繁殖，探究不同浓度盐胁迫对菌株降解苯酚性能有何影响就变得尤为重要。 　　热带假丝酵母菌是一种高效降解苯酚的真菌，但盐胁迫对菌株降解苯酚性能的影响还未见报道，本实验组从污水处理厂的活性污泥中分离得到了一株具有较高降酚活性的热带假丝酵母GY8，并对其基本性质进行了研究[10]。本试验拟采用不同浓度的氯化钠对热带假丝酵母GY8菌株进行盐胁迫，观察高盐对其生长特性、降酚特性及降酚关键酶活性的影响，为将热带假丝酵母GY8菌株应用于高盐含酚废水的处理提供理论依据。
　　1 材料和方法
　　1.1 试验材料
　　1.1.1 样品来源 本研究所用降解苯酚菌株热带假丝酵母 GY8筛选自山西省晋中市太谷县圣源污水处理厂曝气池中的活性污泥，并由本实验组保存。
　　1.1.2 培养基 PDA培养基和PDB培养基：参照本实验室常规方法配制[10]。
　　无机盐筛选培养基（g·L-1）：参照本实验室常规方法配制[11]，加入终浓度为0.1，10，25，50和100 g·L-1的氯化钠，每个浓度设置3个平行组。
　　1.1.3 试剂 本试验中所用化学试剂均为分析纯，PDA培养基和PDB培养基购自北京澳博星科技公司，酵母提取物购自OXOID公司，NADPH购自上海罗氏制药有限公司。其余为国产分析纯。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 热带假丝酵母 GY8菌株活化 将保存菌株热带假丝酵母 GY8在PDA固体培养基上划线，28 ℃恒温培养箱培养2 d。从PDA培养板挑取活化的单克隆菌，接种到灭菌的含PDB培养基的试管中，28 ℃，180 rpm，培养2 d后作为后续试验使用菌株。
　　1.2.2 盐胁迫对热带假丝酵母GY8菌株生长影响 将1.2.1中培养的菌株接种到以苯酚为唯一碳源，氯化钠浓度为0.1，10，25，50和100 g·L-1的无机盐液体培养基中，置于28 ℃恒溫震荡器中，180 rpm，培养2 d，在培养结束后，将培养液摇匀，从每个培养瓶中取150 μL菌液于酶标板中，以蒸馏水为空白对照，测600 nm波长下菌液的OD值。
　　1.2.3 苯酚含量的测定 本文采用4-氨基安替比林法[12]来测定苯酚的含量，略有改进。将培养液于5 000 r·min-1离心5 min后，取上清按照本实验室常规方法测定苯酚含量[11]。
　　1.2.4 盐胁迫对苯酚降解酶活性的影响 （1）粗酶液的提取。将1.2.2中离心后的菌体沉淀用pH=7.6磷酸缓冲液清洗两次，然后用磷酸缓冲液重悬细胞，加入终浓度为1 mg·mL-1的蛋白酶K，放入Scientz-65OE超声波细胞破碎仪中，设定超声工作时长5 s，间隙时长8 s，功率250 W，总工作时长为35 min，超声破碎后，于4 ℃，12 000 r·min-1，离心20 min，收集上清液即为粗酶液[13]。
　　（2）酶活的测定。苯酚羟化酶活力测定参照文献[14]，苯酚羟化酶反应体系总体积为150 μL。每个样品依次加入水，12 μL苯酚（终浓度20 μmol·L-1），6 μL Tris-H2SO4（100 μmol·L-1，pH值7.6），粗酶液和6 μL NADPH（100 μmol·L-1），混匀后取150 μL加入酶标板，以126 μL水，12 μL苯酚，6 μL Tris-H2SO4，6 μL NADPH作为空白对照，用Muitiskan GOI酶标仪检测在340 nm处反应6 min内OD值的变化。其中1个单位（U）的苯酚羟化酶活性被定义为每毫克蛋白每分钟氧化1 μmol NADPH所需酶量。邻苯二酚-1， 2-双加氧酶（C12O）活性测定参照文献[11]，以单位时间内反应产物（粘糠酸）在260 nm处吸光度变化表示。邻苯二酚1， 2-双加氧酶反应体系总体积为3 mL。每个样品中依次加入水，2 mL Tris-HCL（50 mmol·L-1，pH值8.0），1 μL β-巯基乙醇（3.3 mmol·L-1），粗酶液，15 μL邻苯二酚（100 μmol·L-1）。以984 μL水，2 mL Tris-HCL（50 mmol·L-1，pH值8.0），1 μL β-巯基乙醇（3.3 mmol·L-1），15 μL邻苯二酚作为空白对照，用石英比色皿测在260 nm处OD值的变化。总蛋白含量用Bradford 法测定。酶的比活力以每毫克的蛋白质中所含酶的活力单位数计算，计算公式如下：
　　酶的比活力=（（ΔAs-ΔAb）·V）/（ [ε·d·ΔT·mg （protein）]）
　　式中，ΔAs-样品吸光度的变化值;ΔAb-空白对照吸光度的变化值;V-反应体系总体积;ε-摩尔吸光系数;ΔT-反应时间。ε340 = 6 220 L·mol-1·cm-1，ε260=16 800 L·mol-1·cm-1，ε375 = 44 700 L·mol-1·cm-1。
　　2 结果与分析
　　2.1 盐胁迫对热带假丝酵母GY8菌株生长的影响
　　随着培养基中氯化钠浓度的逐渐升高，热带假丝酵母GY8菌液OD600值逐渐降低，表明菌液浓度越来越低，说明热带假丝酵母GY8菌株的生长随着氯化钠浓度的升高逐渐被抑制。其中在10 g·L-1氯化钠胁迫下较0.1 g·L-1胁迫时下降了20.7%，而25 g·L-1氯化钠胁迫下生长明显受到抑制，较0.1 g·L-1胁迫时下降了49.3%（图1）。
　　2.2 盐胁迫对热带假丝酵母GY8菌株苯酚降解率的影响
　　随着培养基中氯化钠浓度的逐渐升高，氯化钠胁迫下热带假丝酵母GY8菌株对苯酚的降解率与菌株的生长都呈现一致的下降趋势，说明随着氯化钠浓度的升高，由于菌株生长受到抑制，从而导致菌株对苯酚的降解也逐渐被抑制。其中10 g·L-1氯化钠胁迫下苯酚降解较0.1 g·L-1时下降了0.18个百分点，而在25 g·L-1氯化钠胁迫下苯酚降解明显受到抑制，较0.1 g·L-1时下降了0.58个百分点，较生长受抑制更加明显（图2）。 　　2.3 盐胁迫对热带假丝酵母GY8菌株苯酚羟化酶活性的影响
　　当热带假丝酵母GY8菌在含有氯化钠的培养基中生长时，苯酚羟化酶的酶比活力呈现先上升后下降趋势。苯酚羟化酶在受到10 g·L-1氯化钠胁迫时活性呈现上升趋势，较0.1 g·L-1时酶活性提高了15.2%，从而在菌生长受到抑制时苯酚降解抑制程度减缓。当菌株在超过25 g·L-1氯化钠胁迫下苯酚羟化酶活性明显受到抑制，较10 g·L-1时下降21.3%（图3）。
　　2.4 盐胁迫对热带假丝酵母GY8菌株邻苯二酚1，2-双加氧酶活性的影响
　　当热带假丝酵母GY8菌生长的环境中氯化钠浓度逐渐升高时，邻苯二酚1，2-双加氧酶的酶活力呈现明显下降趋势，且在10 g·L-1氯化钠胁迫时活性呈现明显抑制作用，较0.1 g·L-1时酶活性降低了72.8%，表明邻苯二酚1，2双加氧酶的表达受到氯化钠的明显抑制（圖4）。
　　3 结论与讨论
　　近年来，从含酚类污染物的环境中分离出各种能够降解苯酚的微生物菌株。研究者还详细地研究了这些菌株代谢苯酚的途径及其基因调控机制[15]。目前，大量的研究工作结果表明，微生物对酚类污染物的降解存在着有效的作用和可观的未来，降酚菌依靠苯酚羟化酶和邻苯二酚1， 2-双加氧酶来降解苯酚[16]。然而，我国的工业特别是化学工业排放的含酚废水中往往含有很高浓度的盐[4]，不利于微生物降解苯酚，因此，用微生物法处理盐浓度高的含酚废水变得非常困难。研究表明，菌株在10～100 g·L-1 的NaCl溶液条件下均能够进行生长，并对苯酚有降解能力，且菌株生长量和苯酚的降解率随着盐度的增加而降低，其羟化酶比活力随之降低[17]。过高盐度会抑制邻苯二酚1，2-双加氧酶基因的表达，其表达水平随盐度升高呈下降趋势[18]。本研究结果中发现浓度低于10 g·L-1的盐环境有利于提高苯酚羟化酶活性，而随着盐浓度逐渐升高，苯酚羟化酶和邻苯二酚1，2-双加氧酶活性菌受到明显抑制作用，因此，高浓度盐的生长环境不利于热带假丝酵母GY8菌对苯酚的转化降解，增大了苯酚降解的难度。通过本实验研究可以通过调整废水中盐度于酶活性范围内，从而为该菌株在盐度较高的含酚废水的处理应用中提供理论依据。
　　
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