猪流行性腹泻病毒S2基因的克隆与遗传进化分析

来源:用户上传      作者:焦文强 邢广旭 刘运超 徐引弟 王治方 王克领 李海利

　　 摘要：为了解猪流行性腹泻病毒（PEDV）新流行毒株的遗传变异情况，本研究对2014—2018年间采集的205份PEDV疑似阳性样品进行RT-PCR检测、扩增PEDV S2基因并进行遗传转化分析。RT-PCR结果显示，205份疑似阳性样品中有191份扩增出单一条带，片段大小为1 887 bp，符合S2基因的扩增预期。试验样品阳性检出率为93.17%。测序分析表明，试验共获得25株S2基因序列，与参考毒株之间核苷酸的同源性为94.3%～99.6%，氨基酸的同源性为86.4%～96.2%。遗传进化分析结果显示，试验得到的PEDV毒株分属于G1、G2亚群。本研究为PEDV防控以及疫苗毒株筛选奠定基础。
　　关键词：猪流行性腹泻病毒;S2基因;克隆;进化分析;阳性检出率
　　中图分类号：S852.65+1  文献标识号：A  文章编号：1001-4942（2020）02-0106-05
　　Abstract In order to investigate molecular evolution of porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） in China， a total of 205 samples including fecal and intestine tissues were collected in 2014—2018 from Henan， Hebei， Shandong， Shanxi， Gansu， Hubei and Jiangxi Provinces. All the samples were subject to RT-PCR and the positive samples were sequenced to obtain the whole S2 gene. The single band with the fragment size as 1 887 bp was amplified from 191 samples， and the positive detection rate was 93.17%. In all， 25 S2 gene sequences were acquired; their nucleotide homology with the control strain were 94.3%～99.6%， and their amino acid homology with the control strain were 86.4%～96.2%. The evolution analysis results indicated that the obtained PEDV strains belonged to the G1 and G2 subgroups. This study could provide informations for the control and prevention of PEDV.
　　Keywords Porcine epidemic diarrhea virus; S2 gene; Cloning; Evolution analysis; Positive detection rate
　　 豬流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea， PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）感染引起的一种猪的高度接触性病毒传染病，临床表现为呕吐、水样腹泻以及脱水等，最终可致猪脱水死亡[1]。该病最早由英国学者发现，后蔓延至欧洲其它国家[2-4]。20世纪90年代，亚洲地区开始报道PEDV的流行[5，6]。我国学者宣和于1984年成功分离PEDV病毒。长期以来，该病毒在我国主要以散发形式存在，直到2010年，从南部省份迅速传播到主要生猪养殖省份，给养猪业造成巨大经济损失[7]。2013年美国暴发PED，至此，PEDV呈现全球分布[8]。
　　 PEDV属于冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状病毒属（Coronavirus），其核酸类型为单股正链RNA，长度约为28 kb。 基因组由5′非编码区（untranslated region， UTR）、3′UTR以及7个开放阅读框组成（open reading frames， ORFs），分别编码3个非结构蛋白（non-structural proteins， NSPs）和4个结构蛋白（structural proteins， SPs），即S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白[9]。其中，S蛋白在PEDV吸附宿主细胞、诱导机体产生中和抗体方面发挥重要作用，S蛋白可以分为S1（第1～789位氨基酸）和S2（第790～1 383位氨基酸）两部分。Park 等[10]研究发现S2基因不仅在膜融合过程中发挥重要作用，其编码的1 368～1 374位氨基酸也是重要的表位之一。因此，深入分析S2蛋白的遗传变异情况对于了解PEDV的抗原位点变化，以及相应病毒毒力的影响等都具有重要作用。
　　 为深入了解PEDV在我国遗传变异情况，本研究对2014年10月至2018年3月采集到的205份PEDV疑似病料进行RT-PCR检测，扩增阳性样品的S2基因序列并测序，旨在为指导临床PEDV的防控工作提供参考。
　　1 材料与方法
　　1.1 病料采集
　　 本研究于2014年10月至2018年3月从河南、河北、山东、山西、甘肃等省区采集疑似PEDV病料205份，包括仔猪小肠组织、粪便以及母猪血液等，并进行分类编码。其中，粪便用PBS稀释离心取上清，小肠组织加入PBS研磨后离心取上清用于检测。所有样品均置于-80℃贮存备用。
　　1.2 主要试剂 　　Taq DNA 聚合酶、鼠源反转录酶（M-MLV）、RNA 酶抑制剂、pMD18-T Simple 载体、DL2000 Marker、JM109感受态细胞、RNA提取试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司;胶回收试剂盒、小型质粒提取试剂盒购自于天根公司;琼脂糖购自Oxoid公司，其它试剂均为国产分析纯。
　　1.3 引物设计
　　 参考GenBank中收录的PEDV毒株S基因序列，GenBank登录号分别为KF272920、KF468752、KC196276、JX188454、KC210145。使用Primer Premier 5.0软件设计引物，上游引物：5′-GGTTTCTTCTACCATTCTAATGACG -3′，下游引物：5′-TCGCTCGAGTCACTGCACGTGGAC-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
　　1.4 PEDV S2基因的克隆与测序
　　按照宝生物RNA提取试剂盒操作说明书完成疑似样品的RNA提取，随即合成cDNA。反应体系包括5×NLV反转录缓冲液2 μL、dNTP 2 μL、MLV反转录酶0.5 μL、RNA酶抑制剂0.3 μL和总RNA 4.9 μL，充分混匀后置离心机瞬时离心混匀，反应条件为42℃ 1.5 h、70℃ 10 min。以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系：Taq DNA 聚合酶1 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各 1 μL，dNTP 4 μL，10×PCR Buffer （Mg2+ plus） 5 μL，无菌双蒸水补足 50 μL。反应程序：94℃预变性5 min;94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，35个循环;72℃延伸10 min。扩增结束后取5 μL PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，回收与预期大小一致的PCR产物，并与pMD18-T Simple载体连接，4℃过夜后转化至JM109感受态细胞，蓝白斑筛选后挑取单克隆进行培养并提取质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。使用MegAlign软件构建系统进化树。
　　2 結果与分析
　　2.1 PEDV S2 基因的扩增
　　利用PCR技术对205份待检样品进行PEDV S2基因扩增，得出191份样品可扩增出单一条带，片段大小为1 887 bp，符合预期。部分扩增结果如图1所示。
　　2.2 205份临床样品PEDV检出率
　　205份临床样品中，有191份样品检测为PEDV阳性，阳性率高达93.17%。其中，小肠的阳性率最高（176/185，阳性率为95.14%）;其次为粪便（11/13，阳性率为84.62%）。各种临床样品的阳性率详见表1。
　　
　　2.3 PEDV S2基因的分析
　　 经测序分析，本研究共得到S2基因序列25株，S2基因全长1 887个核苷酸，共编码625个氨基酸。其中，CH-HENPY-2015株在第18～27核苷酸之间存在10个核苷酸的插入（图2），CH-HENKF-2017在第1 774～1 809核苷酸之间存在36个核苷酸的缺失（图3）。具体这2株毒株核苷酸的插入和缺失对病毒毒力的影响有待于进一步研究。本研究得到的S2基因与参考毒株之间核苷酸的同源性为94.3%～99.6%，氨基酸的同源性为86.4%～96.2%（图4）。
　　2.4 S2基因遗传进化分析
　　 使用本研究得到的S2基因序列与GenBank中下载的序列构建系统进化树，结果发现，试验得到的25株毒株中CH-HENXY-2018、CH-HENPY-2015、CH-SHANGH-2017和CH-HENXX-2017株与CV777、LZC等毒株属于G1亚群，剩余的21株与今年分离的PC22A、MN等毒株同属于G2亚群（图5）。
　　
　　3 讨论与结论
　　目前关于PEDV的遗传进化情况，国内外学者进行过很多研究，但是相关报道主要集中在S1基因、ORF3基因，对S2基因的遗传进化情况鲜有报道。本研究从2014—2018年间采集的PEDV疑似样品中共得到25株S2基因。这些基因序列与国内外参考毒株相比，核苷酸的同源性为94.3%～99.6%，氨基酸的同源性为86.4%～96.2%，表明氨基酸的突变造成了其编码的氨基酸序列的改变，使得PEDV的变异情况更加复杂。其中CH-HENPY-2015株在第18～27核苷酸之间存在10个核苷酸的插入，CH-HENKF-2017在第1 774～1 809核苷酸之间存在36个核苷酸的缺失，这些核苷酸的缺失和插入对于病毒毒力以及免疫原性的影响等方面需要更近一步验证。
　　遗传进化分析显示，CH-HENXY-2018、CH-HENPY-2015、CH-SHANGH-2017和CH-HENXX-2017株与CV777、LZC等毒株同属于G1亚群，其余21株病毒与PC22A、MN、IA1毒株属于G2亚群。说明PEDV进化趋势沿着不同方向，未来需要更多的毒株、更广泛的来源加以分析。
　　参 考 文 献：
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