龙眼DlICE1基因克隆及低温胁迫表达分析

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　　摘  要：本研究以龙眼胚性愈伤组织为材料，根据龙眼转录组数据库，采用RACE-PCR和RT-PCR技术获取龙眼DlICE1 cDNA全长序列，并对其进行生物信息学分析与低温胁迫下表达分析。结果表明，龙眼DlICE1 cDNA全长为2327 bp，其中开放式阅读框（ORF）序列长1614 bp，共编码537个氨基酸。生物信息学分析表明，龙眼DlICE1编码的蛋白质属于不稳定的弱酸性蛋白，不具有典型的信号肽，且不属于分泌蛋白;亚细胞定位表明其位于细胞核内，与甜橙的同源蛋白亲缘关系最近;实时荧光定量PCR表明，龙眼DlICE1能够有效响应低温胁迫，低温诱导其表达量提高。研究结果显示，龙眼DlICE1基因参与龙眼胚性愈伤组织抗寒过程。
　　关键词：龙眼;胚性愈伤组织;DlICE1基因;基因克隆;實时荧光定量PCR
　　中图分类号：S667.2    文献标识码：A
　　Cloning and Expression of Low Temperature Stress of DlICE1 in Dimocarpus longan Lour.
　　HUO Wen， LI Jiami*， XU Xiaoping， LAI Ruilian， CHEN Xiaohui， LIN Yuling， CHEN Yukun，
　　LAI Zhongxiong**
　　Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 35002， China
　　Abstract： In this experiment， the embryogenic callus of longan were used as the materials， the cDNA sequence of DlICE1 was cloned from longan embryogenic callus by the method of RACE-PCR and RT-PCR， then it was analyzed by bioinformatical methods and expression analysis under low temperature stress. The full-length sequence of DlICE1 was 2327 bp， which contained an 1614 bp open reading frame encoded 537 amino acids. The bioinformatics analysis indicated that DlICE1 belonged to the unstable acidic protein， which didn’t has a typical signal peptide and wasn’t a secreted protein; subcellular localization indicated that it is located in the nucleus， which was closest to the homologous protein of sweet orange. The qRT-PCR results indicated that the longan DlICE1 could effectively respond to low temperature stress and induce increased expression at low temperature. In summary， the study suggests that the longan DlICE1 gene may be involved in the cold resistance in longan embryogenic callus.
　　Keywords： Dimocarpus longan Lour.; embryogenic callus; DlICE1 gene; gene cloning; real-time fluorescent quantitative PCR;
　　DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.05.016
　　植物在生长发育过程中，不断受到各种非生物胁迫而严重影响作物的产量、品质以及生长发育。低温是一类重要的非生物因子，可以使植物受到不同程度的伤害甚至死亡。很多植物在寒冷环境下长期生长逐渐进化形成了一套感受和传导寒冷信号的系统，并能够产生一系列适应寒冷环境的变化，以增强抗寒能力[1]。低温诱导植物抗寒性提升的过程称为冷驯化[2]，Weiser等[3]首次提出植物在冷驯化过程中基因表达发生改变的观点。
　　CBF转录因子调控信号路径是目前为止研究最广泛、最受认可的非依赖于ABA途径的转录因子之一。具体过程为ICE1（inducer of CBF expression 1）——CBF转录因子——CRT/DRE（C- repeat binding factor/dehydration-responsive element binding）基序——冷诱导基因COR（cold- regulated）表达——植物抗寒性提升。ICE1基因属于bHLH基因家族，能编码一种特定蛋白结合到CBF3基因启动子的MYC顺式元件上，进而诱导CBF3编码CBF转录因子，CBF与COR基因的顺式作用元件结合，促使COR下游基因表达，进而提高植株抗寒能力[4]。故ICE1的过量表达可以使植物抗寒能力提高[5]。在低温胁迫下，过表达水稻RsICE1可以使其下游冷调控基因OsD REBL和OsTPP1在转录水平上显著上调，说明RsICE1参与了CBF/DREB1冷调控信号网络[6]。王意程等[7]发现低温处理有利于苹果愈伤组织花青苷的累积;低温可以诱导苹果愈伤组织冷信号基因MdICE1以及花青苷合成相关转录因子基因MdMYB10和MdbHLH3的表达。 　　龙眼（Dimocarpus longan Lour.）是无患子科（Sapindaceae）龙眼属（Dimocarpus）植物，属于亚热带果树，喜温惧冷，年均适应生长的温度为20～22 ℃。温度是影响龙眼生长、结实的重要因素，对其产量和品质均会造成不利影响。因此，研究龙眼抗寒相关基因，有助于进一步探讨龙眼抗寒机理的相关问题，对提高龙眼产量、品质有着重要意义。本研究以龙眼‘红核子’胚性愈伤组织及其转录组数据为材料和基础，对DlICE1基因进行克隆以及生物信息学分析，同时采用qRT-PCR技术检测不同温度处理下DlICE1的表达情况，以期为龙眼抗寒机制的后续研究提供科学依据。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　福建农林大学园艺植物生物工程研究所提供的‘红核子’品种龙眼胚性愈伤组织（LC2细胞系）[8]。龙眼胚性愈伤组织的转录组数据GenBank登录号为SRA059205。
　　1.2  方法
　　1.2.1  材料处理  将生长状态良好的龙眼胚性愈伤组织置于不同温度条件下暗培养24 h，设置的温度梯度为0、4、8、12、16、20、24、28、32、36 ℃。暗培养完成后将材料放入液氮中冷冻15 min，随后放入?80 ℃冰箱保存备用。
　　1.2.2  总RNA提取及cDNA第一链合成  采用Tripure法提取龙眼胚性愈伤组织总RNA，经超微量分光光度计测定RNA浓度及吸光值（OD值），以A260/A280下OD值在1.8～2.0之间的测定结果为宜;采用SMART RACE试剂盒将RNA逆转录为cDNA第一链用于基因克隆;采用TaKaRa公司提供的荧光定量试剂盒逆转录成cDNA用于qRT-PCR实验。
　　1.2.3  引物设计  从龙眼转录组数据库中查找、提取DlICE1已有的部分转录组序列（1599 bp），将其序列在NCBI数据库中BLAST，与其他物种进行同源性对比。下载DlICE1基因同源性较高的几个序列，如甜橙（Citrus sinensis）、杨树（Populus trichocarpa）、胡杨（Populus euphratica）等，进行DNAMAN同源对比，参考PCR引物设计原理，运用DNAMAN 6.0软件设计3′RACE、5′RACE及全长验证引物，同时根据全长验证获得序列结合实时荧光定量PCR引物设计原则设计实时定量引物（表1），并将引物序列发送至北京六合华大基因有限公司进行引物合成。
　　1.2.4  目的基因的扩增  以逆转录的龙眼cDNA为模板，将酶、通用引物、设计的RACE引物和无菌水同时加入PCR反应体系进行PCR扩增。PCR反应体系为：94 ℃预变性4 min;94 ℃变性1 min，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，35个循环;72 ℃延伸10 min。参照林玉玲[9]的试验方法，将获得的PCR产物目的片段用1%凝胶电泳鉴定条带是否为目的片段，切割目的片段，进行胶回收，PMD18-T载体进行目的片段的连接，随后在目的片段连接产物中加入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行目的基因的转化;将转化后的产物进行涂板，使其在含LB加Amp的培养板上培养12 h，随后进行挑菌，挑取多个单克隆，进行菌液PCR验证，经凝胶电泳验证，将阳性克隆子发送给上海博尚生物技术有限公司进行基因测序。
　　1.2.5  生物信息学分析  对克隆得到的基因序列使用DNAMAN获得对应氨基酸序列。采用ExPASy对DlICE1蛋白进行基本理化性质分析;采用SignalP 4.0 Server进行信号肽预测;采用Prot Comp进行亚细胞定位分析;采用TMHMM分析蛋白跨膜结构域;采用NCBI-Protein Tools进行蛋白质保守结构域预测;采用NetPhos 2.0 Server进行磷酸化位点与其他功能位点预测;利用COILS Server预测卷曲结构;利用Jpred3预测蛋白二级结构;利用SWISS-MODEL预测蛋白三级结构;采用MEGA 6.0进行同源性和分子系统进化树分析;使用MEGA 6.0将以上序列载入，采用采用最小邻近法，设置Bootstrap为1000进行分子同源系统进化树分析。
　　1.2.6 实时荧光定量PCR表达分析  按照赵双宜等[10]建立的方法分别提取不同温度处理后的龙眼胚性愈伤组织总RNA并编号，经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，采用PrimeScript? RT Reagent Kit（TaKaRa）试剂盒进行cDNA逆转录。实时荧光定量反应参照Lin等[11-12]的步骤方法进行，以龙眼EIF4a、EF-la和FSD作为内参基因，采用罗氏LightCyclers? 480和SYBR? Prumix EX Taq? Ⅱ对不同温度处理下龙眼DlICE1基因进行qRT-PCR实验，重复3次。最后按照Livak[13]等的方法进行定量计算，并通过Excel软件对Cp值进行统计分析与图标制作，采用SPSS 19.0进行数据显著性差异分析。
　　2  结果与分析
　　2.1  龙眼DlICE1 cDNA全长序列获得
　　以龙眼‘红核子’胚性愈伤组织为材料提取总RNA并进行反转录，采用RACE-PCR技术进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到两条目的条带，5′-RACE和3′-RACE所得片段长度分别约为500 bp和400 bp，与目的片段大小一致，产物电泳结果如图1所示。
　　拼接后进行全长验证，获得龙眼DlICE1 cDNA序列全长为2327 bp，其中ORF区域长度为1614 bp，编码537个氨基酸。将所得cDNA序列在NCBI上进行在线BLAST同源性比对，结果显示该序列与其他物种的DlICE1基因同源性均较高，其中與甜橙和河岸葡萄的ICE1同源性最高，其相似率都高达82%，试验结果可确认所得序列为龙眼DlICE1基因的序列。运用DNAMAN获取ORF序列和氨基酸序列如图2所示。 　　2.2  DlICE1基因的生物信息学分析
　　生物信息学结果表明：DlICE1基因共编码537个氨基酸，编码的蛋白分子量为58 930.88 Da。理论PI值为5.15，属于酸性不稳定性蛋白。预测该蛋白不具有典型的信号肽，不属于分泌蛋白。亚细胞定位分析DlICE1蛋白亚细胞很可能位于细胞核内，此外，ICE1蛋白没有跨膜区域。蛋白质保守结构域预测结果显示DlICE1蛋白含有一段与HLH家族一致的保守结构域，位置在第353～397个氨基酸之间，表明DlICE1蛋白属于HLH的超级家族。另外，DlICE1蛋白也含有一段与ACT超级家族类似的保守结构域，位置在第466～526个氨基酸之间。磷酸化位点预测，结果显示总共有51个磷酸位点。COILS预测表明DlICE1蛋白具有形成卷曲螺旋结构的可能。蛋白质二级和三维结构预测分析显示DlICE1蛋白主要由α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲结构构成。
　　使用NCBI在线BLAST将龙眼与其他物种ICE1基因的编码蛋白进行同源性比较分析，结果显示龙眼（Dimocarpus longan Lour）ICE1蛋白与甜橙（Citrus sinensis）的相似度最高为83%。从NCBI下载甜橙（Citrus sinensis）、杨树（Populus trichocarpa）、胡杨（Populus euphratica）、土瓶草（Cephalotus follicularis）、可可（Theobroma cacao）、巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）、甜杨（Populus suaveolens）、木薯（Manihot esculenta）、雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）、小叶杨×欧洲黑杨（Populus simonii  Populus nigra）、棉花（Gossypium hirsutum）、麻风树（Jatropha curcas）、青梅（Prunus mume）、核桃（Juglans regia）、秋子梨（Pyrus ussuriensis）的氨基酸序列。如图3所示，分析不同物种之间的亲缘关系，可以看到龙眼与甜橙处于同一分枝，说明龙眼与甜橙的亲缘关系最为接近。
　　2.3  龙眼DlICE1低温胁迫下的定量表达分析
　　从图4可看出，在龙眼胚性愈伤组织中DlICE1基因不同温度处理下的表达量有显著性差异。在不同温度处理下，DlICE1相对表达量呈先增加再减少的趋势，12 ℃时表达量明显增高并达到最高水平，说明龙眼DlICE1基因对12 ℃最为敏感。通过比较DlICE1基因在0～24 ℃区间和24～36 ℃区间的表达量发现：DlICE1基因0～24 ℃区间整体平均表达水平高于24～36 ℃的区间，说明低温可能诱导DlICE1基因表达，高温则抑制其表达。
　　3  讨论
　　3.1  DlICE1参与龙眼胚性愈伤组织低温胁迫响应
　　研究表明，ICE1基因在多种植物（包括苹果、白菜、芥菜、葡萄、甜杨、可可、萝卜、毛果杨、拟南芥等）中已被克隆获得，并且经生物信息学分析，发现该基因在不同物种中编码的氨基酸序列C端保守性较强，具有典型的ICE基因家族的结构特征，且都含有bHLH结构域，仅在不同物种间所处位置有所差异[14-20]。本研究经同源克隆获得DlICE1基因序列全长，并对其序列、编码的氨基酸以及蛋白结构进行分析，发现龙眼DlICE1基因与其他物种均具有较高的同源性，并且具有典型的ICE基因家族的结构特征。而不同物种的ICE1基因编码的氨基酸序列长度不一;不同植物ICE1蛋白均是亲水性，其编码氨基酸的二级结构和三级结构存在较大差异。龙眼DlICE1基因的生物信息学分析结果与蒋瑶等[14]的研究结果基本一致，说明DlICE1基因在进化过程中是比较保守的，据此推测龙眼DlICE1基因的功能与其他植物DlICE1基因在功能上相似度会比较高，均与提高植物的抗寒性有关。
　　现已发现，ICE1转录因子是调控CBF路径的主开关，ICE1基因在得到表达后，与CBF3基因启动子的顺式元件特异性结合，接着CBF3编码CBF转录因子与COR基因结合，激活COR下游基因表达，进一步使植物做出一系列反应来抵抗外界低温，达到抗寒目的。
　　根据郑银英等[21]的研究结论，ICE1的确能够提高植物的抗逆性，特别是在抗寒性方面。在常温条件下，ICE1不影响植物的正常生长发育，并且会有少量表达来激活冷响应基因，使植物具备一定抗逆性;当处于低温坏境下，ICE1转录因子过量表达激活CBF途径，诱导大量冷响应基因的相继表达，包括控制调节植物物质代谢和生长发育的相关基因，进而增强作物在低温胁迫下的抗逆性与适应性。
　　3.2  低温促进DlICE1基因的表达
　　参考黄莹等[22]的研究成果发现，胡萝卜转录因子DcICE1基因在低温逆境胁迫下会过量表达，其中4 ℃下的表达量最高。根据时慧[23]的研究，发现茶树CsICE1基因不仅在常温下表达，低温胁迫下该基因表达也得到提高。此外在4 ℃条件下，外源ABA可以显著上调茶树CsICE1基因的表达水平。本研究通过实时定量荧光PCR检测龙眼胚性愈伤组织DlICE1基因在不同温度处理的表达情况，其结果表明，低温胁迫会引起龙眼DlICE1基因过量表达，且12 ℃下表达量就已经达到最高，与龙眼对低温敏感这一结论符合。低温逆境胁迫下龙眼胚性愈伤组织DlICE1的表达情况与黄莹等[22]、时慧[23]的研究结果一致，但在达到最高表达量的温度上有所差异，推测其主要原因是不同物种耐受低温的临界温度不同，龙眼是亚热带果树，更适合天气炎热温暖的南方地区种植，故在感受低温上也比胡萝卜和茶树要敏感。
　　高等植物应对低温的抗寒机制比较复杂，受到多方面因素调节限制[24]。Dong等[25]研究发现ICE1的一个负调控因子HOS1（high expression of osmotically responsive gene），它是一个UbE3连接酶，可介导ICE1的泛素化（ubiquitination），最终导致ICE1蛋白的降解。如此看来，低温胁迫下即使ICE1基因过量表达，由于其他因子的限制如HOS1基因表达，植物的抗寒能力也并不一定能够得到提升。事实上，植物也有自己的一套应对方法来保证ICE1蛋白的稳定性，从而在应对低温与寒流时具有一定抗性。Miura等[26]研究发现，拟南芥SUMO（small ubiquitin-like modifier）E3连接酶SIZ1可通过对ICE1苏素化（sumoylation），以解除HOS1所引起的ICE1蛋白泛素化。在龙眼中，肖小娥等[27]研究发现低温时DlHOS1基因表達水平较高，高温时表达水平降低，12 ℃表达量最高，与DlICE1基因表达的趋势几乎一致。这可能是由于龙眼中也存在着ICE1苏素化以解除HOS1所引起的ICE1蛋白泛素化反应所导致。 　　随着近期龙眼基因组的公布[28] ，人类对龙眼的认识取得突破性进展，以后的科研试验可以从基因组水平上对龙眼的生长发育和进化起源等重大问题入手，有利于新基因的发现与物种的改良等。在此研究基础上，结合龙眼基因组数据的运用，研究ICE1基因与其他相关基因在龙眼抗寒过程中的相互作用以及培育龙眼抗寒新品种有了新方向。
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