杏褪绿卷叶植原体新疆分离物16SrDNA基因克隆与序列分析

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　　摘要 利用植原体16S rDNA基因通用引物对新疆轮台县疑似杏褪绿卷叶病植株总DNA进行巢氏PCR检测，扩增出大小约1.2 kb的特异性条带。对扩增产物克隆和测序，确定特异片段大小为1 248 bp。序列同源性比较和系统进化分析表明，新疆杏褪绿卷叶植原体不同分离株16S rDNA基因序列同源性极高，达到99.8%～100%。与16SrⅤ组成员的同源性达到98.2%以上，其中与16SrⅤ-B亚组的枣疯病植原体山东宝山分离株，甜樱桃绿化植原体山东分离株同源性最高，达到99.4%～99.6%。进一步虚拟RFLP分析，结果表明该植原体属于榆树黄化组（16SrⅤ）的一个新的亚组，与其相似性最高的是16SrⅤ-B亚组，相似系数为0.94。本研究首次报道了新疆杏褪绿卷叶植原体16S rDNA的序列，确定了其分类地位，为杏褪绿卷叶病的早期诊断和检测提供了基础。
　　关键词 杏; 杏褪绿卷叶病; 植原体; 16S rDNA; 序列分析
　　中图分类号： S 436.6  文献标识码： A  DOI： 10.16688/j.zwbh.2019046
　　Abstract By using Nested-PCR， the 16S rDNA of phytoplasma of apricot chlorotic leaf roll （ACLR） in diseased sample from Luntai region in Xinjiang was amplified by the universal primer pairs， then a phytoplasma-specific 1.2 kb fragment were amplified by nested-PCR. The 16S rDNA gene was cloned by polymerase chain reaction from samples of ACLR， they were then sequenced. The result of sequencing showed that the ACLR strains from Xinjiang consists of 1 248 bp in 16S rDNA gene. The similarity and phylogenetic analysis showed that the six ACLR isolates sequenced from Luntai region are closely related to each other， displaying 99.8%-100% nucleotide sequence similarity， and the six isolates shared approximately 98.2% identity with 16SrⅤ group， the results of blast showed that the genetic distance of six isolates was closely to the 16SrⅤ-B subgroup，which shared the highest similarity （99.4%-99.6%） with the strains of prunus avium virescence phytoplasma （MF848965） from Shandong and jujube witches’-broom phytoplasma （EU999737） from Shandong. Furthermore， virtual RFLP analysis showed that the phytoplasma belonged to a new subgroup within the elm yellows group（16SrⅤ）， the most similar was the reference pattern of the 16Sr group Ⅴ， subgroup B （GenBank accession： AB05287）， with a similarity coefficient of 0.94. This study reports 16S rDNA sequences of ACLR phytoplasmas and classified phytoplasma of ACLR in Xinjiang for the first time， it provides the base for early diagnosis and detection.
　　Key words apricot; apricot chlorotic leafroll; phytoplasma; 16S rDNA; sequence analysis
　　 杏Armeniaca vulgaris為蔷薇科杏属植物，是中国栽培历史最悠久的果树之一。新疆作为杏的原生起源中心，拥有丰富的杏种质资源，其栽培面积和产量均居中国各省（区）之首。杏褪绿卷叶病（apricot chlorotic leaf roll disease）是危害杏树的一种高致死性植原体病害。该病害于1973年首次在法国杏树上发现，之后陆续在欧洲其他核果类树种如扁桃、欧洲李、樱桃、桃和油桃等多种果树上发现，成为影响欧洲核果类果树商业化栽培的主要病害。中国，欧洲和北美均将其列入进境植物检疫危险性病害名录[1-2]。1993年，赵京民对北京、河北、山西等地出现严重早期落叶的杏树植株的组织切片进行了电镜观察，初步判断可能是由类菌原体所致[3]。2007年李文慧等[4]首次在新疆轮台县的杏园中发现了杏褪绿卷叶病疑似病株，症状主要表现为叶片褪绿斑驳、变红，树冠中、下部甚至全株叶片沿主脉向上翻卷成筒状，早衰落果，果小味差，轻者产量降低，重者4～5 a内整株死亡，通过电镜观察确定引起新疆杏褪绿卷叶病的病原为植原体。 　　本研究于2016-2018年连续3年对新疆轮台县、托克逊县杏褪绿卷叶病发生情况进行调查。发现该病害从零星、局部发生到范围逐渐扩大、发病程度逐年加重，部分杏园的发病率已超过30%，严重的超过60%，患病果园减产可达20%～50%，严重影响杏果品质。该病害对近年来蓬勃发展的新疆经济支柱林果产业带来巨大隐患。本研究对新疆杏生产区杏褪绿卷叶病疑似病株进行植原体16S rDNA PCR 扩增、克隆和序列测定，获取病原菌的分子信息，确定其分类地位和系统发育关系。
　　
　　1 材料与方法
　　1.1 供试材料
　　2016年8月至2018年8月在新疆轮台县国家果树资源圃采集表现为叶片上卷、叶肉有不规则褪绿斑的疑似杏褪绿卷叶病样品。将采集的叶片、枝条、叶柄等组织，保存于保鲜袋内，带回实验室后保存于4℃和-40℃冰箱中。同时采集健康植株枝叶作为对照。
　　试剂及仪器：新型植物基因组DNA提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒、标准分子量Marker购自天根生化科技（北京）有限公司。克隆载体pMD 19T以及其他酶类等分子生物学试剂购自大连宝生物工程有限公司（TaKaRa）。
　　1.2 样品总DNA提取
　　采用新型植物基因组DNA提取试剂盒和改良CTAB法[5]提取杏树叶中脉及韧皮部总DNA。
　　1.3 植原体16S rDNA的巢式PCR扩增
　　1.3.1 引物
　　参照Lee等[6]根据植原体16S rDNA序列设计的通用引物对。R16mF2/R16mR2为外侧引物对，R16F2n/R16R2为内侧引物对。R16mF2： 5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′，R16mR2： 5′-CTTAACCCCAAT CATCGA-3′;R16F2n： 5′-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3′;R16R2： 5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3′。引物由上海生工生物工程技术股份有限公司合成。
　　1.3.2 巢氏PCR扩增
　　以提取的供试样品总DNA为模板，用外侧引物R16mF2/R16mR2进行扩增。反应体系（25 μL）：DNA模板2.0 μL，引物（10 μmol/L）各1.0 μL，dNTPs（10 mmol/L）1.0 μL，10×PCR buffer （含2.5 mmol/L MgCl2）2.5 μL，TaqDNA聚合酶（2.5 U/μL）0.3 μL，灭菌超纯水 17.2 μL。反应条件：94℃ 预变性4 min;94℃变性 45 s，50℃复性45 s，72℃延伸1 min，35个循环;72℃延伸10 min。
　　如外侧引物扩增出目的条带，则将1 μL PCR产物稀释30倍后取1 μL作为模板;如未扩增出目的条带，则直接取1 μL PCR产物作为模板，以内侧引物R16F2n/R16R2进行第二轮扩增。PCR反应体系和条件与第一轮PCR相同。
　　1.3.3 PCR产物电泳分析
　　取PCR產物在添加Goldview染料的琼脂糖（浓度为10 g/L）中进行电泳（1×TAE 缓冲系统），使用凝胶成像系统观察并拍摄图片。
　　1.4 PCR产物的回收与克隆
　　将巢式PCR产物中的特异性条带切下，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，纯化。回收的PCR产物与载体pMD19T在16℃下连接2 h。将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，在含有X-gal （20 g/L）、IPTG （50 g/L）、Amp （100 mg/L）的LB琼脂平板上37℃培养14～16 h，形成单菌落。将筛选出的阳性单菌落接种于含Amp （100 mg/L）LB液体培养基中，在37℃培养过夜，提取质粒，用R16F2n/R16R2进行PCR扩增、酶切鉴定。
　　1.5 序列测定与分析
　　将筛选获得的含有目的片段的重组质粒送上海生工生物工程股份有限公司进行序列测定。所得序列在NCBI数据库（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）中进行BLAST检索，通过DNAMAN 5.2.2将测得序列与植原体16Sr各组中的代表性植原体的16S rDNA序列进行核酸同源性比较，利用MEGA 5.0软件[7]的邻接法（neighbor-joining）构建系统发育树。并利用植原体分类鉴定在线工具iPhyClassifier[8]和pDRAW32软件对杏褪绿卷叶植原体新疆分离物及植原体16SrⅤ组各亚组参考株系16SrⅤ-A （AY197655）[9]、16SrⅤ-B （AB052876）[10]、16SrⅤ-C （AY197642）[11]、16SrⅤ-D （AY197644）[11]、16SrⅤ-E （AY197650）[12]、16SrⅤ-F （AB689678）[13]、16SrⅤ-G （AB052879）[10]、16SrⅤ-H （KJ452547）[14]、16SrⅤ-I （KR233473）[15]的16S rDNA序列（R16F2n/R16R2扩增片段）进行Alu Ⅰ等17种限制性内切酶的虚拟酶切分析，根据限制性片段长度多态性分析结果鉴定出褪绿卷叶植原体新疆分离物所在组为16Sr组/亚组。
　　2 结果与分析
　　2.1 新疆杏褪绿卷叶病症状表现
　　与健康植株相比，感病植株树冠中、下部甚至全株叶片从叶柄到叶尖边缘沿主脉向上翻卷成筒状，叶片表面呈不规则褪绿斑驳，感病株果实的生长发育受到抑制，果实成熟期推迟，品质变劣，产量严重下降，随着感病年数的增加，病情逐渐加深，直至整株干枯、死亡（图1）。
　　
　　2.2 新疆杏褪绿卷叶植原体16S rDNA巢式PCR扩增结果  利用植原体通用引物对R16mF2/R16mR2对杏褪绿卷叶病、枣疯病病株和健康杏树植株总DNA进行PCR扩增，电泳结果显示，枣疯病病株总DNA可以扩增出1条约1.5 kb的特异性片段，而杏褪绿卷叶病病株、健康杏树植株和灭菌超纯水空白对照均未出现特异性条带（图2a）。进一步以杏褪绿卷叶病病株第一轮PCR产物为模板，利用内侧引物对R16F2n/R16R2进行第二轮PCR扩增，结果扩增出约1.2 kb的特异性片段，同时枣疯病植原体也扩增出相同的特异性条带，而健康植株和灭菌超纯水均未出现特异性条带（图2b）。结果表明，所用引物对具有特异性，可从疑似病样中扩增到与目的基因片段大小相符的条带。疑似病样中存在植原体。 　　2.3 杏树褪绿卷叶植原体16S rDNA片段的序列分析
　　随机选取6个杏褪绿卷叶病病样的巢氏PCR扩增产物进行回收、纯化、克隆，提取质粒，经PCR和酶切鉴定后，选取阳性克隆进行测序。结果表明，从6个病样中获得的片段大小均为1 248 bp，G+C含量为45.91%～45.99%，符合植原体16S rDNA基因G+C含量（45%～49%），命名为ACLR-XJ01～ACLR-XJ06，登录号分别为（MH587702～MH587707）。
　　同源性比较结果表明，新疆杏褪绿卷叶植原体不同分离株16S rDNA基因片段核苷酸序列无明显差异，相似性达到99.8%～100%。与植原体16Sr各组代表性植原体比较结果表明，杏褪绿卷叶植原体新疆分离物ACLR-XJ01～ACLR-XJ06与植原体16SrⅤ组成员的相似性达到97.6%以上，与16SrⅤ-B亚组的枣疯病植原体山东宝山分离物BS1（EU999737），甜樱桃绿化植原体山东分离物SCV-JN-2013（MF848965）相似性最高，均达到99.4%～99.6%。其中BS1和SCV-JN-2013与ACLR-XJ01～ACLR-XJ04仅有5个碱基的差异，与ACLR-XJ05和ACLR-XJ06有8个碱基的差异。
　　2.4 系统进化及虚拟RFLP分析
　　将本研究获得的6个杏褪绿卷叶植原体新疆分离物16S rDNA序列与GenBank中已公布的部分16Sr组代表性植原体16S rDNA基因序列进行比较，利用MEGA 5.0软件的邻接法（neighbor-joining）构建系统发育树。系统进化树显示（图3），杏褪绿卷叶植原体新疆分离物ACLR-XJ01～ACLR-XJ06与16SrⅤ组各亚组代表性植原体成员聚在同一进化分枝上，属于16SrⅤ组成员。同时与16SrⅤ-B亚组各株系的亲缘关系最近，聚在一个分枝上，但又单独聚为一簇。进一步利用植原体在线分类系统iPhyClassifier对6个杏褪绿卷叶植原体新疆分离物进行虚拟RFLP分析，结果表明，本研究获得的植原体16S rDNA基因片段的限制性片段长度多态性不同于已有的16Sr组/亚组。其中与16SrⅤ-B亚组分离物（GenBank登录号：AB052876）的相似性最高，相似系数为0.94，在限制性内切酶BstU I和Rsa I的酶切位点上存在明显的差异，因此系统推测本研究获得的杏褪绿卷叶植原体新疆分离物可能属于16SrⅤ组的一个新亚组。
　　3 讨论
　　依托特殊生态地理环境所赋予的丰富光热资源，新疆杏有着优异的品质。近年来，新疆杏生产规模快速扩大和迅猛发展，形成了环塔克拉玛干沙漠独特的杏生态品种群和杏产业带，对于地处极端干旱荒漠区、生态环境极为脆弱的南疆地区防风固沙、生态环境保护和促进地区经济发展都有着重要的意义。杏褪绿卷叶病自2007年首次在新疆出现以来，已从零星发生转为成片发生，发生面积不断扩大，部分成年果园的发病率呈逐年升高的趋势，给新疆杏生产带来严重隐患。本研究利用巢式PCR 扩增、序列分析、同源性比较等分子生物学方法对杏褪绿卷叶植原体新疆分离物进行分子检测鉴定，获得了其16S rDNA分子信息，从亚组水平上确定了其分类地位，为建立新疆杏褪绿卷叶植原体快速诊断和检测提供技术支持。
　　近年来国际上对ACLR的病原、流行学、寄主范围、检验检疫等方面开展了不少研究，取得了一定进展[16-17]。尽管不同国家所报道的杏褪绿卷叶病症状相似，但各国所报道的ACLR病原包括分类地位不同的多种植原体。如捷克、土耳其、比利时、白俄罗斯等国发生的ACLR病原被鉴定为16SrⅩ-B亚组[18-21]，黎巴嫩、德国发生的ACLR病原被鉴定为16SrⅠ-F亚组[22-23]，伊朗发生的ACLR病原被鉴定为16SrⅡ-C亚组[24]。还有研究发现，ACLR病原与苹果丛枝植原体（apple proliferation phytoplasma，16SrⅩ-A）、梨衰退植原體（pear decline phytoplasma，16SrⅩ-C）和翠菊黄化植原体（aster yellow phytoplasma，16SrⅠ-A）具有相似的DNA序列，序列相似度为98.6%～99.1%，差异部位在16S rDNA第16～19位点，但倾向于将杏褪绿卷叶植原体归于苹果丛枝病植原体类群[25]。而本研究发现，引起新疆杏褪绿卷叶病的植原体在系统分类上应归于16SrⅤ组。由此可见，杏树可被多种植原体侵染并引起相似的症状，而新疆杏褪绿卷叶病株中是否还有其他不同分类地位的植原体，是否存在混合侵染现象还有待进一步检测证实。
　　植原体分类鉴定在线工具iPhyClassifier在植原体亚组及株系的分类研究中已得到广泛应用。本研究利用该方法对患病杏树植株中植原体的16S rDNA序列进行RFLP分析，发现16S rDNA基因片段的限制性内切酶片段多态性不同于所有已建立的16Sr组/亚组的参考模型。其中与16SrⅤ-B亚组分离物（GenBank登录号：AB052876）的相似性最高，相似系数为0.94（相似系数≤0.97建议该植原体可代表新的植原体16Sr亚组[8]），因此推测本研究获得的杏褪绿卷叶植原体新疆分离物属于16SrⅤ组的一个新亚组。通过对16S rDNA序列同源性及系统发育分析，发现杏褪绿卷叶植原体新疆分离物与16Sr V-B亚组的枣疯病植原体山东分离株、甜樱桃绿化植原体山东分离株亲缘关系很近，序列相似性达到99.4%～99.6%，最多有8个碱基存在差异，且在同一条进化小分支上，在分子水平上未体现出不同株系间的差异。随着植原体分类的深入研究，研究人员发现仅依靠16S rDNA序列对植原体进行分类鉴定存在严重的局限性，因此，有必要进一步测定核糖体蛋白基因（rp）、延伸因子基因（tuf）、运转蛋白基因（SecY）等较16S rDNA具有较大变异性的基因或区域以获取更加丰富的分子生物学信息，从而更加深入了解杏褪绿卷叶植原体新疆分离物与其他植原体的系统进化关系和分子水平差异，为植原体致病机制研究与新疆杏褪绿卷叶病的防治奠定基础。 　　參考文献
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