套细胞淋巴瘤C-myc基因、LSD1表达及临床意义
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[摘要] 目的 探究套细胞淋巴瘤C-myc基因、LSD1表达及临床意义。 方法 回顾性分析2010年1月～2015年12月就诊于我院的30例套细胞淋巴瘤（MCL）患者的临床资料，将其纳入研究组，并将同时期的30例增生性淋巴结炎患者临床资料纳入对照组。采用SP免疫组织化学方法检测两组病例病理组织中C-myc、LSD1蛋白表达情况，并应用小干扰RNA（siRNA）沉默套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞的C-myc基因，Western blot检测C-mycsiRNA作用后凋亡相关蛋白C-myc、Bcl-2、Procaspase3表达水平。分析C-myc、LSD1蛋白表达与套细胞淋巴瘤临床病理分期的相关性及C-mycsiRNA对套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞凋亡相关蛋白C-myc、Bcl-2、Procaspase3的影响。 结果 经Spearman相关性分析显示，C-myc、LSD1蛋白表达与MCL临床病理分期无相关性（P>0.05）。C-mycsiRNA处理Jeko-1细胞24 h后，Western blot 检测显示凋亡相关蛋白C-myc、Bcl-2、Procaspase3表达呈浓度依赖性下降。 结论 C-myc、LSD1蛋白表达与MCL临床病理分期无相关性，干扰Jeko-1细胞C-myc基因后可下调凋亡相关蛋白C-myc、Bcl-2、Procaspase3表达水平，C-myc基因可能成为靶向治疗的新靶点。
[關键词] 套细胞淋巴瘤;C-myc;LSD1;相关性;siRNA;凋亡相关蛋白
[中图分类号] R733.1 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2020）08-0147-04
Expression of C-myc gene and LSD1 in mantle cell lymphoma and its clinical significance
ZOU Zongkai CHEN Shunping LIN Yanling JI Siling HUANG Zhiyong
Department of Pathology， Zhangzhou Hospital Affiliated to Fujian Medical University， Zhangzhou 363000， China
[Abstract] Objective To explore the expression of C-myc gene and LSD1 in mantle cell lymphoma and its clinical significance. Methods The clinical data of 30 patients with mantle cell lymphoma（MCL） who were treated in our hospital from January 2010 to December 2015 were retrospectively analyzed and included as the study group， and 30 patients with proliferative lymphadenitis in the same period were included as the control group. SP immunohistochemistry was used to detect the expression of C-myc and lysine specific demethylase 1（LSD1） proteins in the pathological tissues， and small interfering RNA（siRNA） was used to silence the C-myc gene of MCL Jeko-1 cells. Western blot was used to detect the expression of apoptosis-related proteins C-myc， Bcl-2， and Procaspase3 after C-myc siRNA treatment. The correlation between the expression of C-myc and LSD1 proteins and the clinicopathological stage of MCL and the effect of C-myc siRNA on the apoptosis-related proteins C-myc， Bcl-2， and Procaspase3 of MCL Jeko-1 cells was analyzed. Results Spearman correlation analysis showed that there was no correlation between C-myc and LSD1 protein expression and clinical pathological stage of MCL（P>0.05）. After C-myc siRNA treatment of Jeko-1 cells for 24 hours， Western blot showed that the expression of apoptosis-related proteins C-myc， Bcl-2， and Procaspase3 decreased in a concentration-dependent manner. Conclusion There is no correlation between the expression of C-myc and LSD1 proteins and the clinical pathological stage of MCL. Interfering with the C-myc gene in Jeko-1 cells can down-regulate the expression of apoptosis-related proteins C-myc， Bcl-2， and Procaspase3. The C-myc gene may become a new target for targeted therapy. [Key words] Mantle cell lymphoma; C-myc; LSD1; Correlation; siRNA; Apoptosis-related protein
非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin’s lymphoma，NHL）是发病率较高的恶性肿瘤，而套细胞淋巴瘤（Mantle cell lymphoma，MCL）占NHL的5%～6%，其会导致患者淋巴结肿大，并常常伴随全身症状[1]。大部分MCL患者在确诊时多为中晚期病变，且多已出现外周血或骨髓浸润，危及患者生命，需及早诊断与治疗。组蛋白去甲基化酶（Histone demethylases，HDM）、组蛋白甲基转移酶（Histone methytransferases，HMT）共同调节组蛋白的甲基化状态，进而调控染色质的基因表达及结构改变。C-myc基因可促进细胞增殖及分裂，与NHL的发生密切相关[2]。赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1（Lysine specific demethylase l，LSD1）可调控基因的表达，使细胞内一、二甲基化的组蛋白3赖氨酸4（H3K4）去甲基化[3]。但目前有关NHL中C-myc、LSD1表达的研究较少。因此，本实验进一步探究C-myc、LSD1在套细胞淋巴瘤中的表达及临床意义，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
回顾性分析2010年1月～2015年12月就诊于我院的30例MCL患者临床资料，将其纳入研究组，并将同时期的30例增生性淋巴结炎患者临床资料纳入对照组。MCL诊断符合《套细胞淋巴瘤诊断与治疗中国专家共识（2016年版）》[4]相关诊断标准，并经病理组织学及免疫组织化学确诊。研究组中男21例，女9例;年龄51～78岁，平均（66.20±2.50）岁;经典型25例，多形性型1例，母细胞型4例。Costwolds临床分期：Ⅰ期6例、Ⅱ期9例、Ⅲ期7例、Ⅳ期8例。对照组中男22例，女8例;年龄52～77岁，平均（66.15±2.45）岁。两组性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 试剂与仪器
胎牛血清、PMSF以及BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，型号分别为E600001-0500、A610425-0025、C503051-0500;Lipo 2000购自Invitrogen公司，型号为11668-019;psPAX2购自巴菲尔公司;兔单抗CD81（26KD）、鼠单抗CD63（26KD）均购自abcam公司，型号分别为Ab109201、Ab108950;全自动免疫组织化学染色仪为美国罗氏 BenchMark XK。
1.3 方法
（1）采用全自动免疫组化检测套细胞淋巴瘤和增生性淋巴结炎C-myc、LSD1蛋白表达，构建两组患者的组织芯片，SP法免疫组织化学染色，以PBS代替一抗作为阴性对照，用购买的阳性对照片作为阳性对照。结果根据着色强度和着色细胞所占百分比的积分之和进行判断，若两种积分之和>2分为阳性，≤2分为阴性，计算各组的平均积分。由有经验的病理科医师采用双盲法评估。（2）套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞生长于含10%胎牛血清的1640细胞培养基，并在37℃、5%CO2饱和湿度的孵箱中进行培养，取对数生长期细胞进行试验。根据C-myc基因在GenBank中的序列原则设计相对应特异性siRNA。转染前选择对数生长期细胞，离心收集并接种于6孔培养板中，转染时细胞密度达到8×105～16×105/mL。设定空白对照组、随机阴性对照组。将稀释后的lipofectamineTM2000室温放置5 min后与稀释的C-myc siRNA混合并室温放置20 min以便形成转染复合物0.5 mL，将其加入含有细胞的无抗培养基中，使终体积为2 mL。在培养箱（37℃、5%CO2饱和湿度）中培养24 h后，提取各组细胞总mRNA并反转录为cDNA，采用实时荧光定量PCR检测各组LSD1基因表达水平。WB方法检测C-mycsiRNA作用24 h后Jeko-1细胞凋亡相关蛋白C-myc、Bcl-2、Procaspase3表达。（3）病理检查：标本10%浓度的中性福尔马林固定后常规进行石蜡切片、HE染色和免疫组化染色，用显微镜观察细胞组织形态和免疫组化染色结果，由2名资深病理医师共同诊断。
1.4 评价指标
（1）分析套细胞淋巴瘤病理组织中C-myc、LSD1蛋白表达与临床病理分期相关性。①临床病理分期：Ⅰ期：肿瘤局限于单个淋巴结或淋巴区;Ⅱ期：入侵≥2个淋巴结或淋巴区，但仍在横膈膜单侧;Ⅲ期：肿瘤细胞扩散于横膈膜两侧;Ⅳ期：肿瘤细胞已转移至多个器官。②分级根据着色细胞所占比例与着色强度综合判断。C-myc无阳性细胞为0分，阳性细胞数<10%为1分，10～30%为2分，>30%为3分。LSD1无阳性细胞记为0分，阳性细胞数量按<25%、25～50%、51～75%、>75%分别记为1分、2分、3分、4分。著色强度按无着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别记为0分、1分、2分、3分。将以上二者得分相加，0分为Ⅰ级，1～2分为Ⅱ级，3～4分为Ⅲ级，5～7分为Ⅳ级。Ⅳ级为阳性高表达。由经验丰富的病理医师根据双盲法评估。（2）探究C-mycsiRNA对套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞凋亡相关蛋白C-myc、Bcl-2、Procaspase3表达水平的影响。
1.5 统计学方法
采用SPSS18.0统计学软件进行数据处理，计数资料用[n（%）]表示，采用χ2检验，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，相关性采用Spearman相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 C-myc蛋白表达与临床病理分期相关性分析 C-myc与MCL临床病理分期无相关性（r=0.000，P>0.05）。见表1。
2.2 LSD1蛋白表达与临床病理分期相关性分析
LSD1表达与MCL临床病理分期无相关性（r=0.000，P>0.05），见表2。LSD1的阳性产物主要定位在细胞核，其在MCL中的表达见封三图12。
2.3 C-myc siRNA对套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞凋亡相关蛋白的影响
C-myc siRNA处理Jeko-1细胞24 h后，Western blot 检测显示凋亡相关蛋白C-myc、Bcl-2、Procaspase3表达呈浓度依赖性下降，见图1、封三图13。
3 讨论
MCL属于恶性淋巴瘤，具有侵袭性与惰性，早期无明显症状，大部分患者确诊时多为Ⅲ或Ⅳ期病变，且多无法治愈，严重威胁患者生命安全[5-6]。目前，采用CHOP方案治疗MCL患者的疗效不满意，仅有少数患者可得到完全缓解，因此，寻求更好的治疗方案，尤其是探究新型治疗靶点十分必要。
本研究结果显示，经Spearman相关性分析显示，MCL病理组织中C-myc、LSD1蛋白表达与临床病理分期无相关性。分析原因在于，C-myc基因是一种转录因子，也是一种癌基因，可通过易位重排与基因扩增方式活化，与多种肿瘤密切相关。肿瘤的发生可能与C-myc基因、细胞周期素CyclinD1、凋亡相关蛋白Bcl-2、Procaspase3协同作用有关。C-myc基因与其产物C-myc蛋白可调节G1细胞周期分布、细胞增殖、分化、并可以促进DNA的复制、与某些肿瘤的发生过程密切相关[7-8]。
组蛋白共价修饰包括组蛋白甲基化、磷酸化、乙酰化等过程，是表观遗传学的重要内容[9]。其中组蛋白甲基化异常会导致对应染色质结构改变，影响下游相关基因的转录水平，使其控制细胞增殖、分化、凋亡水平紊乱，进而诱发肿瘤[10-11]。LSD1是第一个组蛋白去甲基化酶，结构由三部分组成，包括一个胺氧化酶结构域、一个SWIRM结构域以及中心TOWER塔形结构域 。LSD1可促使H3K4和H3K9等单、双甲基化的赖氨酸去甲基化[12-13]。邹宗楷等[14]于相关研究中对LSD1、H3K4mel、H3K4me2在MCL中的高阳性表达进行比较，并分析三者间的相关性，发现LSD1在MCL中呈高表达，可对H3K4的甲基化水平进行调节，其与肿瘤的关系与H3K9甲基化水平上升、H3K4甲基化水平下降相关。LSD1可通过H3K4甲基化及去甲基化异常来影响MCL细胞周期及增殖、凋亡，进而促进肿瘤发展[15]。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种新兴基因阻断技术。应用siRNA干扰技术抑制LSD1的转录水平，可降低LSD1mRNA和相关蛋白的表达，进而可明显MCL细胞株的增殖分化活性。
C-myc siRNA处理套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞24 h后，Western blot 检测显示凋亡相关蛋白C-myc、Bcl-2、Procaspase3表达呈浓度依赖性下降，同时可激活凋亡效益因子Procaspase3转化为caspase3，引发程序性细胞凋亡发生，说明干扰C-myc基因后可下调凋亡相关蛋白C-myc、Bcl-2、Procaspase3表达水平。C-myc基因可能成为靶向治疗的新靶点，其原因在于RNA干扰（RNAi）属于新型基因阻断技术，小干扰RNA（siRNA）可抑制C-myc基因的转录水平，降低C-mycmRNA和凋亡相关蛋白的表达，从而对套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞株的增殖分化活性进行抑制。
综上所述，套細胞淋巴瘤中C-myc、LSD1蛋白表达与Costwolds临床病理分期无相关性，干扰套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞中C-myc基因可下调凋亡相关蛋白C-myc、Bcl-2、Procaspase3表达水平，影响细胞增殖分化活性，C-myc基因可能成为靶向治疗的新靶点。
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（收稿日期：2019-12-26）
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