猪腹泻相关冠状病毒检测方法研究进展

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　　摘要：猪腹泻相关的冠状病毒是可引起猪只呕吐、腹泻和脱水等相关症状的传染性疾病，仔猪感染后死亡率可达100%，对养猪业造成了巨大的经济损失，为此，众多学者对该病的诊断与检测方法进行了大量的研究，建立了临床诊断、病原分离等传统的诊断方法以及免疫学、分子生物学等新兴诊断方法。研究猪腹泻相关冠状病毒的诊断与检测方法对该类疫病的防控具有重要的意义。对猪腹泻相关冠状病毒的检测方法研究进展进行了综述。
　　关键词：猪;腹泻;冠状病毒;病原学;免疫学;分子生物学;检测方法
　　中图分类号：S858.28        文献标识码：A        文章编号：1007-273X（2020）07-0011-03
　　猪腹泻病是危害养猪业的主要传染病之一，引起猪只腹泻的病因很多，包括有营养性腹泻、病毒性腹泻、细菌性腹泻和寄生虫感染等，其中以病毒性腹泻的发生率最高、危害最严重[1]。常见引起猪只腹泻的病毒有猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV），猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）和猪Delta冠状病毒（Porcine deltacorona virus，PDCoV）[2]。这3种病毒均属冠状病毒科冠状病毒亚科。病毒分类委员会将冠状病毒分为甲型冠状病毒、乙型冠状病毒、丙型冠状病毒和丁型冠状病毒，其中PEDV和TGEV属于甲型冠状病毒，PDCoV属于丁型冠状病毒[3]。冠状病毒是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒颗粒呈球形或椭圆形，大小在60～220 nm，基因组全长25～32 kb，含有多个开放阅读框（Open reading frame，ORF）。猪冠状病毒基因组的结构、复制方式和病毒蛋白的表达与人及其他动物的冠状病毒相似，大多数冠状病毒包含四种结构蛋白：一个大的表面糖蛋白（Spike或S），一个小的膜蛋白（SM），一个完整的膜糖蛋白（M）以及一个核衣壳蛋白（N）。甲型冠状病毒其基因组由5’非编码区、0RF1、ORF1b、S、ORF3、E、M、N、3’非编码区组成。丁型冠状病毒基因组从5’-3’依次为5’非编码区、ORF1ab、S、E、M、NS6、N、NS7、N和3’非編码区组成[4]。其中S基因保守区域，M基因和N基因常用作检测的靶基因。PEDV、TGEV和PDCoV都能引起仔猪发生呕吐和水样腹泻，严重还会导致厌食、脱水等症状，潜伏期短，传播迅速，多发生在冬季，且以混合感染比较常见。病理剖检以小肠内壁明显变薄，肠腔内积满黄色黏稠液体以及肠壁小肠黏膜绒毛萎缩、坏死为主要特征。这3种病临床症状相似且常有混合感染的情况，给病原的鉴别诊断带来了一定难度，因此对这3种病原进行准确快速的鉴别诊断，对该病的防控具有重要的意义。本文对此类疫病的病原检测方法研究进展进行了综述。
　　1  病原学检测
　　1.1  病毒的分离与鉴定
　　病原的分离鉴定是传统的检测方法，常采用细胞培养，鸡胚接种和动物接种3种方法分离病原，其中细胞培养是目前分离冠状病毒的最常用的方法。可用猪唾液腺、猪小肠上皮和猪甲状腺原代细胞以及Vero、McClurkinST、LIC-PK和猪肾传代细胞细胞系进行病毒的分离培养，根据病毒在细胞培养中增殖的指标即细胞代谢变化、血细胞吸附（HAd）、干扰现象和细胞病变效应（CPE）评价病毒的感染效果，病毒数量与感染性指标通过蚀斑实验（PFU）和50%组织细胞感染量（TCID50）进行测定。常用Vero细胞分离PEDV，ST细胞分离TGEV以及LIC-PK细胞分离PDCoV。如任玉鹏等[5]等将疑似感染PEDV病猪病料处理后接种Vero细胞，经连续传代成功分离到PEDV DY毒株;孙秋燕等[6]利用ST细胞成功分离到两株TGEV;秦毅斌等[7]利用LLC-PK传代细胞系分离到一株PDCoV。研究证实，胰蛋白酶、氟林蛋白酶以及TMPRSS2蛋白酶等参与冠状病毒S蛋白的激活，在冠状病毒的感染和释放中起重要作用，因此可通过添加蛋白酶增加相关病毒的分离率[8]。
　　1.2  病毒的电镜观察
　　电镜观察也是检测病原常用的方法之一，可通过电镜负染法观察病原的分布，在发病期间，病毒存在于病猪的许多器官中。尤其在空肠、十二指肠和肠系膜淋巴结中含病毒量最高。通过电镜观察，病毒粒子多分布于胞浆的空泡和肠壁微绒毛间隙，但这3种病原均为冠状病毒且形态相似，普通透射电镜观察时很难区分，需要利用免疫电镜技术进行鉴别，免疫电镜技术是一种将含有特殊标记的抗原与抗体相互配对融合，借助特殊电子显微镜对抗原做出定位、定性和半定量的技术手段。王继科等[9]设计出能快速定性PEDV和TGEV且具备3次筛选作用的电镜技术，施雯[10]对PEDV进行分离培养鉴定，借助普通透射电镜和免疫电镜对比观察，证实其表面具有典型的纤突结构，该方法具有高度精确、快速灵敏等优点，但是需要通过特殊的电镜仪器，造价昂贵且不适用于大批量的样本检测。
　　2  免疫学诊断技术
　　2.1  血清中和实验
　　中和实验的原理是利用抗原抗体的特异性结合，当两者结合后会减弱或消灭病毒感染力的实验。动物受到病毒感染后，体内产生特异性中和抗体，并与相应的病毒粒子呈现特异性结合，可通过检测病原或产生的相应抗体进行确诊。具体操作方法包括猪的接种法和细胞培养法，根据发病或细胞病变的情况判定结果。中和试验常用的稀释方法有两种，一种是固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合，另一种是固定血清用量与等量系列对数稀释的病毒混合。此类检测方法操作简单，检测快速，适用于大批量的样本检测，但抗体间存在交叉反应，特异性不强，且因猪从感染病毒到产生抗体需要一定时间，所以也不适用于早期诊断。 　　2.2  酶联免疫吸附实验
　　酶联免疫吸附实验（ELSA）是用特殊标记抗原或抗体以检测与之对应的抗体或抗原的微量诊断技术，也是目前实验室使用最广泛的检测方法之一。Rodak等[11]采用PEDV M蛋白的单抗设计出竞争ELISA，结果表明该方法适用于调查分析猪腹泻病。张清真[12]建立了TGEV双抗夹心ELASA检测方法，最低检测量为17.5 ng/μg，灵敏度高。Thachil等[13]利用PDCoV S1蛋白保守区域作为抗原建立间接ELISA方法。如今还衍生出细胞ELISA和ABS-ELASA等更高效、更快捷的新型检测技术。该方法虽然具备很好的灵敏度、特异性和稳定性，诊断速度快且适用于大量的血清样品鉴别分析，但是容易产生交叉反应，造成误检。
　　2.3  胶体金试纸条检测技术
　　胶体金是一种常用的标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型技术，目前在检测中的应用主要是免疫层析法和快速免疫金渗滤法，此方法检测病原具有简单、快速、准确和无污染等优点。贾宇旻等[14]等建立了快速检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）的胶体金免疫层析方法（GICA），与RT-PCR阳性符合率为93%，检测快速且对检测人员无特殊要求，适合猪场腹泻病原的快速检测，但检测结果有待进一步确认。
　　3  分子生物学诊断技术
　　3.1  聚合酶链式反应
　　聚合酶链式反应是实验室常用且十分重要的分子生物学技术之一，它是以待检或需要特定扩增的DNA片段为模板，利用DNA聚合酶的酶促反应，通过特异性引物，经变性、退火和延伸组成一个完整反应周期进行循环复制。由于异物序列与目的基因必须严格配对，这也决定PCR方法具有很高的特异性。随后出现的商品化PCR检测试剂盒使得该检测技术在操作上更加简单、方便和快捷，得到广泛应用。在实际生产中，人们根据不同需求，运用传统生物技术结合近代基因工程衍生出荧光定量PCR、原位PCR、巢氏PCR、多重PCR和恒温隔绝式PCR等一些新型的PCR方法。其中针对M基因、N基因和S基因保守区域设计引物的RT-PCR法是目前临床应用中最常用的方法，该方法特异性好，成本低，结果准确。韦学雷等[15]针对PEDV、PDCoV和TGEV的M、N、S基因保守区域设计引物，建立了能同时检测3种病原的多重RT-PCR方法。与单重RT-PCR方法相比，多重RT-PCR方法可实现单次多种病原的同时检测，省时省力。荧光定量PCR也是近年发展迅速的一门检测技术，通过在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，并实现对未知模板定量分析。这种方法克服了传统PCR易污染和缺乏准确定量的缺点，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快和全封闭反应等优点，国内外众多学者建立了多种针对PEDV、TGEV和PDCoV的单重或多重荧光定量PCR方法。如施开创等[16]建立了PEDV、TGEV和PRCoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，此方法可快速、高效、准确地对病原实现鉴别诊断，为疾病的早期防控奠定了基础。除此之外，适用于现场快速检测的恒温隔绝式PCR也得到广泛的应用，这种方法解除了实验设备及复杂操作的束缚，可实现产房现场快速检测，实现病原的早诊断、早预防。
　　3.2  环介导等温扩增技术
　　介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新的体外扩增特定DNA片段的方法。该技术依赖于自动循环的链置换反应，在等温条件下，1 h内即能扩增1×109拷贝的靶序列，核酸研究和病原学检测等方面得到了广泛的应用。罗亚坤等[17]建立了猪流行性腹泻病毒的LAMP检测方法，在60 ℃恒温下反应60 min，能特异性地扩增出猪流行性腹泻病毒的核酸片段，与常规RT-PCR方法的符合率达到97.3%，LAMP检测方法无需额外的昂贵设备，仅需要水浴或加热块在30～60 min内扩增大量核酸且结果易观察，操作方法简便、敏感性和特异性高，可以用于相关冠状病毒临床病料的快速检测，但由于其费用昂贵且容易产生气溶胶污染，在临床上并未得到广泛应用。
　　3.3  基因芯片、核酸探针杂交技术
　　基因芯片技术是同时将大量的探针分子固定到固相支持物上，借助核酸分子杂交配对的特性对DNA样品的序列信息进行高效解读和分析，如刘志鹏[18]建立了同时检测PEDV、TGEV、GAR和PDCoV的可视化寡核苷酸芯片，为4种猪腹泻病毒的同步鉴别诊断提供了一种新的分子诊断技术。核酸探针是将特定标记物通过随机引物法、PCR法和缺口平移法等标记到某段特定的核苷酸上，与待检核酸样品在一定的支持物上进行杂交，然后通过一定显示系统来探查靶核酸的一种特异性检测方法。这2种新兴技术具有特异性好、灵敏度高和便捷快速等优点，在临床诊断上具有良好的发展前景。
　　3.4  限制性酶切片段长度多态性分析
　　限制性酶切片段长度多态性分析（Restriction fragmen tlength polymorphism，RFLP）是一种区分具有抗原相关性病毒的有效手段，将抗原性较近的病毒核酸用特定的限制性内切酶进行酶切，然后对酶切的产物进行分析，从而可以达到区分被检病毒核酸的目的。此方法可以用来鉴别野毒株与疫苗株及强毒株和弱毒株[19]，利于对流行毒株进行精准检测，以便从分子层面制定防控措施。
　　4  讨论
　　猪腹泻病毒流行广泛，危害严重。与仔猪病毒性腹泻相关的猜原主要以冠状病毒为主，包括TGEV、PEDV、PDCoV、PHEV和SADS-CoV，虽然猪的冠状病毒都有共同的分子生物学特征，但要求对不同的疾病采取有针对性的预防和控制措施。尤其是前3种病毒已在我國猪群中长期存在且污染面广，由于它们在临床上都可以引起猪的呕吐、腹泻等症状，而且都属于冠状病毒，难以从临床症状和病原学形态方面加以区分，因此必须通过实验室诊断而确诊，只有开展快速有效的检测，才能早诊断、早预防，为开展疾病的综合防控奠定基础。 　　文中介紹的各种检测方法都是目前应用较广泛的实验室检测方法，其中传统检测手段如病原分离、电镜观察等方法结果可靠，但往往操作较复杂或耗时较长，实际应用有一定困难。免疫学检测手段如血清中和实验和酶联免疫吸附实验在鉴别诊断方面或多或少存在缺陷，至今还没有一种可靠的试剂盒问世。分子生物学技术的应用为诊断相关病毒提供了强有力的手段，是今后诊断技术发展的方向，特别是近年来实时荧光定量PCR、等温环介导及基因芯片技术为病毒诊断提供了一种更为迅捷可靠灵敏的检测手段。尽管如此，传统诊断方法的诊断价值不容忽视，在实际应用中可以根据实验目的需要选择合适的检测方法，也可以综合应用2种或2种以上的检测方法进行诊断，为相关病毒的防控和净化带来技术支撑和保障。
　　我国是养猪大国，猪群丰富，冠状病毒的暴发一般呈地方性流行，由于冠状病毒很难被彻底清除，且猪的这几种冠状病毒和人类冠状病毒（HCV229E）的抗原性与基因序列相关，根据病毒中和免疫荧光交叉反应以及用单克隆抗体与蛋白S/N或M进行鉴定，它们都有S蛋白的亚单位Ac，这些同种成分，说明这几种病毒其实都是同一始祖病毒的变异株，病毒有可能在猪和其他宿主（如蝙蝠）以及第二宿主上得到进化，并通过中间传播进入肉食动物，这应该引起我们的充分重视。
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